显微镜成像方法与技术-（PPT 精品）.ppt

第一讲、显微镜的发展简史和分类 视场数 视场数定义为目镜的视场光阑的直径（以mm为单位）。 通过目镜能够观察到的物体表面实际视场(Field Of View, F.O.V.)由以下公式计算 F.O.V.=目镜视场数 / 物镜倍率（mm) 例如，蔡司的10X目镜视场数是23，当使用40X的物镜时，实际视场大小为23/40=0.575mm。 视场数与目镜的放大倍数一起标示在目镜镜筒上，如蔡司10X目镜上标示有10X/23，23即视场数。尼康10X目镜上标示有10X/22，即视场数为22。 荧光显微镜E600使用步骤 1. 实验前一小时，打开空调和风机； 2. 打开汞灯电源开关，预热10-20分钟； 3. 选好细胞后，点燃汞灯，选择合适的滤光块观察荧光图像； 4. 荧光显微镜光源寿命有限 ，标本应集中观察，以节省时间，保护光源。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。 5. 实验结束后请立即关闭汞灯； 6. 水镜使用完后请用无水乙醇清洁； 7. 仪器使用完毕后登记使用情况，使用过程中出现问题及时汇报，保持室内清洁。 体式荧光显微镜使用步骤和注意事项 1. 打开显微镜和电脑的电源插座开关。 2. 打开显微镜控制器电源，系统自检，显微镜触摸屏显示。打开卤素灯电源。 3. 打开电脑，进入操作软件。注意：必需先打开显微镜电源，系统自检完毕后才能进入操作软件。 4. 实验结束后先退出软件，然后点击显微镜触摸屏“Power Off”关闭显微镜。关闭卤素灯电源和显微镜控制器电源。 5. 关闭显微镜和电脑的电源插座开关。 注意：样品准备好以后再打开汞灯电源。汞灯寿命有限 ，标本应集中观察，以节省时间，保护光源。汞灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。实验结束后请立即关闭汞灯电源。 仪器使用完毕后请登记使用情况，出现问题请及时汇报； 请保持仪器设备的清洁，勿乱扔纸屑！ 蔡司的体视荧光显微镜，型号：STEREO LUMAR. V12 变倍体：0.8-10X；物镜：0.8X；目镜：10X；总放大倍数：6.4-80X 数码冷CCD：型号Axio Cam MRc，像素2584*1936，光谱范围400-700nm 显微镜控制器 卤素灯 触摸屏 调焦轮 放大倍数调节轮 卤素灯光纤 数码相机 汞灯电源 汞灯灯箱 （九）全内反射显微镜 全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光，大大降低了背景光噪声干扰，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 光学原理 当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，就发生了全反射现象。全反射发生后，折射光有一个临界状态沿着折射面传播，这部分光我们称之为隐失波，其能量在Z轴上呈现指数衰减。 θc = sin-1（n2/n1） Depth of evanescent wave TIRFM的实现是通过改变激光的入射角来实现的，按技术TIRF显微镜分为两种：棱镜型和物镜型。 棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像。 物镜型TIRF显微镜采用大数字孔径物镜产生衰逝波，同时采用物镜收集荧光成像。物镜型TIRF的应用更为广泛。 TIRF显微镜利用物理光学全内反射原理，使用激光光源，并调整入射角度，配合高孔径值物镜，使激光由物镜入射至样本时，在盖玻片与样本介质(主要为水溶液)的交界面，产生光学全内反射现象。此现象使光源不至于穿透交界面而激发整体样本，只有距盖玻片表面厚度不到200 nm范围内的区域为受激发范围，且受激强度随着与盖玻片表面的距离呈指数衰减。因受激发的范围大量减少，此技术可避免非焦面样本产生的发散荧光，故能解决非焦面荧光杂光的问题，达到光学切片的清晰化效果。 整体而言, TIRF为加强显微荧光影像轴向分辨率的一种光学技术，此技术最适用于观察贴近盖玻片表面区域的荧光样本，如观察细胞膜相关的生理作用，及活体外单分子交互作用的研究等。 TIRF显微镜 　Epi-Fluorescence TI