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揭示细胞通信：磷酸化蛋白的检测与分析

信号通路分子

在探究信号传导途径中，检测信号通路分子的磷酸化状态是揭示其活性变化的关键步骤。以NF-κB信号通路为例，核心蛋白如p65、

IKK和IκBα等的激活往往伴随着磷酸化事件。传统的Westernblot技术在这一领域发挥着重要作用，它不仅能检测特定蛋白的表达水

平，还能通过特异性的磷酸化抗体来评估这些分子的磷酸化水平。与仅仅监测蛋白的表达量相比，检测磷酸化蛋白的含量更能直接反映

信号通路的激活状态。例如，p-p65的增加而p65总量不变，通常表明NF-κB通路被激活。这种检测方法为研究信号转导提供了一个

强有力的工具，使我们能够深入理解信号通路在细胞生理和病理过程中的作用。

磷酸化蛋白检测

蛋白样品制备注意事项：

1.目的蛋白特性确认：

明确目标蛋白是否涉及磷酸化，以及是否通过磷酸化事件激活下游信号传导。

2.实验变量后的时间延迟：

在加入实验变量后，通常需要至少48至72小时才能进行蛋白质信号的检测，具体时间应基于信号转导的预期时间和预实验结果确

定。

3.低温快速操作：

蛋白质提取过程中，保持低温和操作迅速，以避免蛋白降解。

4.添加磷酸酶抑制剂：

在裂解液中加入磷酸酶抑制剂，占裂解液体积的1%，以保护磷酸化蛋白不被破坏。

Westernblotting实验过程中的注意事项：

1.及时进行电泳：

样品收集后，应尽快进行电泳，以防止放置时间过长导致磷酸化蛋白降解或影响其表达量。

2.温和操作：

电泳、转膜、封闭的过程与一般蛋白的Westernblotting过程相同，但需注意在封闭及之后的洗膜过程中，避免过于剧烈的晃动，

且尽量将带有磷酸化蛋白的条带单独封闭和洗膜。

3.抗体选择：

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对于同一蛋白的磷酸化和非磷酸化状态的检测需要使用两种不同的抗体。在磷酸化蛋白检测中，选择高灵敏度、效果好的抗体至关

重要。一抗孵育应至少在4℃下进行12小时，因为磷酸化蛋白含量较低，需要足够长的时间进行孵育。

4.总蛋白检测：

在进行磷酸化蛋白检测的同时，也要进行总蛋白检测，以确保蛋白表达量的变化不是由于样品加载量的差异所导致的。

分析

图像和数据分析的基本步骤：

1.图像分析软件应用：

利用如ImageJ等图像分析软件，对Westernblot结果中的条带进行灰度值分析，从而获得定量数据。

2.磷酸化水平的相对定量：

通常，磷酸化蛋白的水平变化通过将其与相应总蛋白水平的比值来表示，例如p-p65与p65的比值，这有助于在总蛋白水平稳定的

情况下，准确反映磷酸化水平的变化。

结果的可视化和图形组合：

1.结果图的布局：

在展示结果时，将磷酸化蛋白、总蛋白以及内参蛋白的条带排列在一起，这样可以直观地展示磷酸化水平的变化（参见图1）。

2.统计结果的表达方式：

在统计结果的表达上，主要有两种方法：

第一种方法是分别将磷酸化蛋白和总蛋白与内参蛋白进行比较（参见图2）。

第二种方法是计算磷酸化蛋白与总蛋白水平的比值（参见图3）。

通过这些方法，研究人员可以准确地分析和比较不同样本或条件下磷酸化蛋白的表达水平，进而揭示信号通路的活性变化和生物学

意义。这些数据不仅有助于理解蛋白质功能和细胞调控机制，还能为疾病机理研究和药物开发提供重要信息。

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