蛋白质部分笔记.docx

操作试剂原理分离蛋白质亚基尿素，盐酸弧，高浓度盐断裂二硫键链内：先过甲酸氧化切割，再巯基化合物还原切割链间：反之（烫发原理）或直接过量β-巯基乙醇N端氨基酸鉴定1、2,4-二硝基氟苯（DNFB）（sanger试剂）2、丹磺酰氯（DNS-Cl）（强荧光剂）3、异硫氰酸苯酯（Edman降解法）（利用Edman降解，一次能连续测出60-70个氨基酸残基的肽段顺序，也有报导一次测定90-100个残基顺序的）1、由于硝基苯与氨基结合牢固，不易被水解，因此当DNP-多肽被酸水解时，所有肽键均被水解，只有N-末端氨基酸仍连在DNP上，混合液中只有DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯，所以可以用乙酸乙酯抽提并将抽提液进行色谱分析，从而用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。2、碱性条件下，氨基被酰化，通过电泳或层析，鉴定出N-末端氨基酸3、测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，最后以色谱法鉴定出。优点：异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。C-端二氯亚砜，五氯化磷羧肽酶（Carboxypeptidase，CP）羧肽酶是催化水解多肽链含羧基末端氨基酸的酶。酶活性与锌有关。羧肽酶A：是水解由芳香族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端。比如酪氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸等羧肽酶B：主要水解碱性氨基酸形成的羧基末端。羧肽酶A可以切割C端除了Lys、Arg、Pro的氨基酸羧肽酶B可以切割C端的Lys或Arg肼解后N-末端为Phe：C-末端为Phe胰蛋白酶：赖氨酸或精氨酸的羧基末端糜蛋白酶：芳香族氨基酸羧基末端CNBr：甲硫氨酸的羧基末端DNFB-,PTH-：N-端的判断坂口反应为阳性：ArgLiBH4还原后水解，产物有甘氨酸的氨基乙醇：C-端为甘氨酸与茚三酮反应为黄色：Pro Hyp未经糜蛋白酶处理，不能发生DNFB反应：环肽2,3-二磷酸甘油酸红细胞中的2，3-DPG与脱氧血红蛋白结合，使脱氧血红蛋白的空间构象稳定，从而降低血红蛋白对O2的亲合力，促使O2和血红蛋白解离?红细胞中2，3-DPG浓度的改变来调节组织获O2量血红蛋白（Hb）由珠蛋白和亚铁血红素结合而成.它可以在肺部或腮部临时与氧气分子结合,该分子中的Fe2+在氧分压高时,与氧结合形成氧合血红蛋白（HbO2）；在氧分压低时,又与氧解离,身体的组织中释放出氧气,成为还原血红蛋白,由此实现运输氧的功能而二氧化碳大部分是由血浆运输的 1、血红蛋白的氨基可以与CO2 结合 NbNH2 + CO2 == NbNHCOOH == NbNHCOO- + H+2、CO2进入红细胞与水结合形成碳酸，碳酸迅速分解为HCO3-和H+二硫键可稳定三级结构，但却是一级结构内容非常稳定质量小的蛋白质中，含较多二硫键多数寡聚蛋白质分子亚基排列对称对称性是最重要性质之一二级结构不涉及侧链构象如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDS—PAGE后，就只出现一条蛋白质区带SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异蛋白质分类按分子性状纤维状蛋白：结构作用（例子：胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白，丝蛋白）球状蛋白：水溶性好按组成成分单纯蛋白质结合蛋白质按生物学功能酶，调节蛋白，转运蛋白，结构蛋白等氨基酸分子残基平均相对分子量为120α构象中每个氨基酸残基上升高度为0.15nmβ折叠构象中上升高度为0.36nm质子受体带负电（碱）质子供体带正电（酸）pH=Pk+lg（质子受体/质子供体）酸性pI=(pK1+pK2)/2碱性pI=(Pk2+pK3)/2寡态氨基酸：先写解离态，再两性离子两侧的离子取平均值先边缘，再中间先酸碱，再中性就近牛胰核糖核酸酶蛋白质的变性与复性三级结构是由一级结构决定的低pH值，羧基质子化，蛋白质分子带大量净正电荷，分子内正电荷相斥使蛋白质变性，疏水基团暴露，溶解性降低，产生沉淀少量盐，对稳定带电基团有利，但盐过量，盐离子夺取与蛋白质结合的水分子，蛋白质表面水化层被破坏，蛋白质沉淀等电点时，静电斥力最小，溶解度最小非极性溶剂减小表面极性基团的溶剂化作用，促使蛋白质分子间形成氢键，来取代蛋白质分子与水间的氢键测定蛋白质一级结构测定多肽链数目，根据蛋白质C`或N`末端物质的量和蛋白质的相对分子质量可确定蛋白质分子中多肽链数目拆分多条多肽链。拆分以非共价键相缔和的多肽链。用8mol/L的尿素，6mol/L盐酸弧或高浓度盐处理，拆开亚基断裂肽链内部二硫键，断开一条肽链内半胱氨酸残基间的二硫键测每条肽链的氨基酸组成，分离，纯化