血红蛋白的提取和分离shk.ppt

二实验操作1.样品处理和粗分离血液血浆水分其他物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）两个a－肽链两个β一肽链共四条肽链90％每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。①目的：去除（）②方法：（）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（），此基团可携带（）。血红蛋白因含有（）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色烧杯再加入用（）的（）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌10min，（）离心.五倍体积生理盐水低速短时间如此重复洗涤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三黄色洗涤过程图解血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色(2)血红蛋白的释放加（）到（）体积，再加40％体积的（）（溶解细胞膜），置于（）上充分搅拌10min（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水123456第1层（最上层）：（）甲苯层第2层（中上层）：（）色薄层固体，（）的沉淀层。第3层（中下层）：（）的液体，（）的水溶液层。第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色脂溶性沉淀层滤纸用过滤，除去，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂溶性沉淀物烧杯取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是（）或用于更换样品中的（）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液(4)透析（粗分离）1小结：样品处理和粗分离红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。去除小分子杂质。血红蛋白的纯化01(1)凝胶色谱柱的制作单击此处添加正文。02(2)凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱凝胶色谱操作----⑴凝胶色谱柱的制作：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:(2)凝胶色谱柱的装填：立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱(3)样品的加入和洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品注意：