萌發麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定实验报告.doc

萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定 研究背景及目的 酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。因此，对酶的研究是十分重要的。通过对酶活性的测定，可以更好地了解生物体的代谢过程。 其中，淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称生物体中广泛存在的一类生物大分子它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比pH5.6的柠檬缓冲液： A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液； （3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入）； （4）麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml）； （5）0.4M NaOH； 试剂甲： （A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。 （B） 0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 按上述方法进行操作同时进行。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 淀粉酶活力测定液： 管号 8 9 10 11 12 13 14 15 项目 α-对照管 α-测定管 α+β-对照管 α+β-测定管 OD520 0.218 0.209 0.351 0.339 -0.008 -0.008 0.133 0.129 OD520均值 0.214 0.345 -0.008 0.131 麦芽糖浓度（mg/ml） 0.023 0.037 -0.001 0.014 水溶性蛋白标准曲线： 管号 1 2 3 4 5 6 蛋白质浓度 0 50 100 150 200 250 OD650 0 0.129 0.248 0.369 0.462 0.551 水溶性蛋白测定液： 管号 7 8 9 OD650 0.510 0.485 0.495 OD650均值 0.497 蛋白质含量 2.16% 结果计算与讨论分析 A —α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度 A’— α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度 B —α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B’— α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 A=0.037mg/ml；A’=0.023mg/ml；B=0.014mg/ml；B’=-0.001mg/ml α-淀粉酶活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）= 0.56毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1； （α-+β-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）= 12毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1； 在对α+β-对照管的麦芽糖浓度进行测定时，它的消光值为负值。经查阅资料，我们认为出现复制的原因是空白管的浓度低于所测管的浓度。根据标准曲所拟合的方程，α+β-对照管的麦芽糖浓度为负值显然是不合理的，但是，为了保证α+β-测定管与α+β-对照管中的浓度之差计算准确，暂且将α+β-测定管中的麦芽糖浓度表示为负值，该表示不具有实际意义，仅为计算服务。 经计算，（α-+β-）淀粉酶总活性远高于α-淀粉酶活性。若通过直接相减得到β淀粉酶活性，则β淀粉酶活性将会远高于α-淀粉酶活性。 我们知道，α-淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链