细胞因子与细胞粘附因子的测定.PPT

第十四章 细胞因子与细胞粘附因子的测定;第二节趋化因子与趋化因子受体的特性与应用 一、趋化因子特性及其功能 二、趋化因子受体特性及其功能 三、趋化因子的生物学功能;第四节临床常用的测定方法 一、酶联免疫吸附试验 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价;第三节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 ;一、教学目的： 1、熟悉细胞因子常见的检测方法。 2、掌握不同检测方法的优缺点及细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用。 ; 是由机体活化的免疫细胞及某些基质细胞分泌的活性小分子蛋白质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应。 ;据产生细胞类型分类： 淋巴因子：IL-2，4，10， 单核因子：G-CSF、M-CSF、TNFa 按功能分类 白细胞介素（interleukin, ILs） 干扰素（interferon, IFNs） 集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF） 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNFs） 生长因子（Growth factor,GF) 趋化性细胞因子（chemokine） ;（一）白细胞介素;（二）干扰素;（三）肿瘤坏死因子;（四）集落刺激因子;（五）趋化性细胞因子;（六）生长因子;一、细胞因子的共同特性与作用方式;; I L-2 I FN-? TNF-?;IL-4;;;二、细胞因子受体的共同特性与作用方式; 趋化因子，是指一组分子质量为8-12KD的小分子蛋白。该家族成员蛋白质结构中均含有半胱氨酸，根据半胱氨酸的位置、排列方式和数量，分为四类：CC趋化因子,CXC趋化因子,C趋化因子,CXXXC趋化因子。;细胞粘附分子（cell adhesion molecule, CAM） 众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合的分子，大多为跨膜糖蛋白。;一、细胞黏附分子的特性 按其结构特点可分为： 整合素家族的细胞黏附分子 免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子 选择素家族的细胞黏附分子 可溶性的黏附分子;（一）整合素家族的细胞黏附分子;（二）免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子;（三）选择素家族的细胞黏附分子;（四）可溶性黏附分子;第四节 临床常用的测定方法; 1.基于DNA检测的分子生物学测定法： DNA扩增法 RNA印迹法 原位杂交法 核酸酶保护分析 ;根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示;以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。; 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素51Cr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。;③抗病毒活性测定法;④趋化活性测定法;敏感性较高 特异性不高 操作繁琐 易受干扰;一、酶联免疫吸附试验;敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性。;二、流式细胞分析法：; 是荧光素标记的细胞因子特异的单克隆抗体，在一定条件下，与活化的靶细胞内的特异细胞因子结合，然后再用流式细胞仪分析荧光标记的阳性细胞百分率和平均荧光强度，其与细胞内细胞因子的含量成正比。 优点为可测定单个细胞的细胞因子产生特性。;使用流式细胞分析法，可以： ?区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 IFN-γ Th2细胞 IL-4 ?细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态;三、酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot) ;抗特定细胞因子的抗体包被固相微孔＋靶细胞培养＋酶标抗特定细胞因子的抗体＋底物显色剂，并可在