miR-192负性调控人肝癌细胞株HepG2中RB1基因的表达.pdf

第 4O卷第 6期第 656页 华 中科技大学学报 (医学版) Vo1．40 No．6 P．656 2011年 12月 ActaM edUnivSciTechnolHuazhong Dee． 2O11 miR一192负性调控人肝癌细胞株 HepG2 中RB1基因的表达* 谢琼慧 ， 王梦漪。， 谢卫 国 ， 何星星 ， 常 莹 ， 蒋 翔 ， 阮琼芳 ， 林菊生 华 中科技大学 同济医学院附属 同济医院肝病研究所 ，武汉 430030 武汉市第三医院烧伤研究所 ，武汉 430060 。华 中科技大学 同济医学院附属 同济医院肿瘤科 ，武汉 430030 摘要 ：目的 探讨 miR-192对人肝癌细胞株 HepG2中RB1基 因表达 的调节作用 。方法 运用生物信息学方法对 miR一192进行靶基 因预测并分析其潜在靶基 因RB1；将含有 miR一192结合位点的RB1mRNA3端非编码 区 (3UTR)片 段和在 miR-192结合位点进行突变的RB13UTR突变片段克隆至报告基因载体 pMIR—Reportluciferasevector，重组质 粒分别命名为 pMIR—RB1和 pMIR—RB1一mut；将重组质粒、Beta—gal内参质粒和 microRNA共转染 HepG2细胞 ，双荧光 素酶报告基 因系统检测各实验组 中细胞荧光素酶的表达 ；SYBRGreen荧光定量 PCR和 Westernblot分别在 mRNA和 蛋 白水平检测 miR一192对 内源性RB1表达的调节作用。结果 生物信息学分析筛选出89个 miR-192的潜在靶基因， RB1基因是其 中之一；测序验证重组质粒 pMIR—RB1和 pMIRRB1-mut构建成功；过表达 miR-192时，共转染 pMIR— RB1质粒 的细胞相对荧光素酶活性 (4．80±0．36)较相应过表达 miR—NC组 (7．9O±0．91)明显降低 (PO．05)，而共转染 pMIR—Luc或pMIR—RB1一mut质粒的细胞相对荧光素酶活性 [pMIR—Luc：(7．68±1．04)；pMIR—RB1一mut：(7．56±0．99)j 较相应过表达 miR-NC组[pMIR—Luc：(7．86±0．73)；pMIR-RB1一mut：(7．82±1．05)]无显著差异 ；上调 miR一192水平显 著降低HepG2细胞中内源性RB1mRNA[(O．56±0．10)vs(1．05±0．13)]和蛋 白(47 vs100 )的表达。结论 RB1 基 因是 miR-192的一个靶基因，在 HepG2细胞中，miR-192通过直接结合 RB1mRNA3UTR而负性调控 RB1基 因表达。 关键词 ：miR一192； RB1基 因； HepG2细胞 ； 基 因表达 中图分类号 ：R349．64 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2011．06．006 NegativeRegulationofExpressionofRB1bymiR一192inHuman Hepat0cellularCarcinomaCellLineHepG2 XieQionghui ，WangMengyi。，XieWeiguo etal InstituteofLiverDiseases，。DepartmentofOncology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege， HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China InstituteofBurns，WuhanThirdHospital，Wuhan430060，C