第四章放射自显影技术.ppt

第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日由于很难测定由放射性产生的银粒分布的端点，故必须采用其它参数来定义分辨力。L.achmann和M.M.Salpeter（1965）将包含源产生的总银粒数的一半的以点源为中心的源的半径（半半径，HR）定义为分辨力。对于线源，则将包含源产生的银颗粒的一半时任何一边离源的距离，称为半距离（HD）。HD随样品厚度、乳胶层的厚度、晶体颗粒的大小等变化，但若以HD为单位，对源周围的银粒分布做曲线，则在所有情况下都具有相同形状的曲线，因而产生了万能曲线。它反映可在所有条件下银粒的分布，也适用于任何核素。利用万能曲线可以通过计算机来预测各种形状的源周围的粒子分布（图6-4）。就单像来说，分辨力所给的定义是以银粒密度最大的点与银粒密度减少一半的点之间距离（称为半距离HD）来表示。HD数值越小表示分辨力越高，所得到影响越清晰。反之分辨力就低，影像模糊，难以区分(表6－2)。第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日二、制作放射自显影的基本过程生物材料的标记→自显影样品的制备→自显影的制作→曝光→显影→定影→观察与分析（定位及放射性测量）。三、放射自显影的基本类型依样品和观察部位的大小，分宏观和微观自显影；后者又有光学自显影（IMARG）和电镜自显影（EMARG）。1、宏观自显影将宏观的标记样品与固体照相乳胶接触曝光，显影，定影后，形成黑白图象，用肉眼观察或光密度计测量黑度来分析放射性物质在器官组织中的分布情况。2、光学显微自显影通常在常规的组织学切片或涂片上涂上一层液体乳胶膜，经曝光，显影，定影后，在显微镜下观察银颗粒的分布，来了解放射性标记物在细胞间或细胞显微结构中的分布情况。观察的范围很小，要求分辨力高，在材料标记，切片制作，乳胶膜的制作及观察分析上要求更高的技术。3、电镜自显影在超薄切片上涂上单层乳胶膜，经曝光、显影、定影后，在电子显微镜下观察银颗粒的分布，来了解放射性物质在细胞超微结构中的分布情况。甚至可观察到生物大分子的标记部位。观察的结构部位很小，要求分辨力高，在材料标记，切片制作，乳胶膜的制作及观察分析上要求更高的技术。第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日放射自显影技术第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日Northern杂交rat第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日brainRadishleaf第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日四、放射自显影的特点ARG既是一种辐射探测方法，又是一项完整的同位素示踪技术。它与一般用制备的放射性样品，通过电离或闪烁探测器检测放射性的示踪技术相比，有下列主要优点：1、能够准确定位依自显影的类型不同能检测放射性物质在器官、组织、亚细胞结构、甚至在生物大分子中的分布。至于用自显影获得的细胞，亚细胞和分子水平上放射性物质的分布是用一般的生物化学分离法难以获得或不能获得的。2、具有很高的灵敏性因为照相乳胶对射线的反应具有累积作用，所以通过延长曝光时间可以检测到样品中微弱放射性。3、资料形象，易于保存获得的自显影图像能清晰反映放射性物质在器官、组织、和各结构部位的分布情况，形象、客观并能长期保存。第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日虽然放射自显影技术有着其他方法无法比拟的优点，但同样存在一些不足之处：1、自显影的制备时间过长手续较复杂，尤其显微自显影要求较薄的技术；2、不能直接定量一般情况下只能相对定量。因此，除了在细胞学、分子生物学和遗传学研究中的特殊目的外，在一般的示踪实验中，放射自显影作为放射性检测的一种手段，补充提供放射性物质的吸收，运转和分布的资料。第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日第二节宏观放射自显影（Macro-autoradiography）的制作以宏观材料制作的自显影，肉眼或光密度计观察组织、器官中放射性物质的分布。一、样品的制备1、植物材料整株或部分器官（枝条、叶片、花蕾等），压制成标本要求干而不脆，平整。若植株过大可折转或剪断。若观察放射性物质在茎杆中的分布，可制成茎杆的纵横切片。2、动物材料整体切片：纵剖面或横剖面，或组织的宏观切片。3、层析谱纸层或薄层板展开后，充分干燥，可喷射聚氯乙烯或硝化纤维（polyvinylchlorideornituocellalose），以防止自显影时薄层板上吸附剂粉的移动。4、凝胶电泳块为防止水分对乳胶的影响可采取：（1）干燥；（2）包蔽；（3）冰冻：在低温条