DB22_T2566-2016_b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法_吉林省.docx
ICS07.100
DB22
C04
吉林省地方标准
DB22/T2566—2016
b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法
MultiplexpolymerasechainreactionmethodforthedetectionofHaemophilus
吉林省质量技术监督局
发布
DB22/T2566—2016
前言
本标准根据GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。
本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。
本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。
本标准主要起草人：张炜煜、杨修军、王慧、刘桂华、赵薇、黄鑫、李可维。
I
DB22/T2566—2016
b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法
警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问
题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。
1
范围
本标准规定了b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法。
本标准适用于b型流感嗜血杆菌核酸的实验室检测。
2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB19489-2008实验室生物安全通用要求
GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用
缩略语
4.1.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，20mmol/L氯化镁。
4.1.44dNTP（10mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP
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DB22/T2566—2016
4.1.5TaqDNA聚合酶
4.1.6分子量标记：100bp～2000bpDNA条带（DNALadder）
4.1.710×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/L
EDTA，溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。
4.1.8琼脂糖：电泳纯
4.1.9溴化乙锭
4.2质控菌株
流感嗜血杆菌ATCC9795(b型)、流感嗜血杆菌ATCC49247（N型）、流感嗜血杆菌ATCC10211(丢失
荚膜的b型)。流感嗜血杆菌ATCC9795(b型)菌体DNA作为阳性对照。
4.3引物及探针
4.3.1流感嗜血杆菌种属特异性引物：
Hi-F：5’-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT-3’
Hi-R：5’-TGTGCCTAATTTACCAGCAT-3
4.3.2流感嗜血杆菌荚膜特异性引物：
Hi-af-F：5’-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC-3’
Hi-af-R：5’-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3’
4.3.3b型流感嗜血杆菌特异性引物：
Hib-F：5’-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC-3’
Hib-R：5’-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA-3’
5.6微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL
5.7静脉采血管
6试验步骤
6.1样品
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DB22/T2566—2016
用接种环挑取培养基上疑似菌落，置于200μL无菌双蒸水中，振荡混匀形成悬浮菌液。
6.1.2
血液
在儿童中，10%～20%低菌量菌血症患者是由流感嗜血杆菌引起的。采集静脉血（3mL～5mL）置
于含有抗凝剂的采血管中，并标记。
6.1.3脑脊液
应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集的脑脊液（要求1mL）置于无菌、螺帽管中，并
标记。
6.1.4
咽拭子
将咽拭子绕过悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3～5滴无菌生理盐水的试管中，待检。
6.2细菌DNA的提取
对于上述标本，各取0.1mL加到一个0.2mL无菌双蒸水中，振荡混匀，100℃煮沸10min，13000
rpm/min离心10min，吸取上清液即为DNA模版；使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模
板DNA。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照，试剂对照。如不能及时检测，提取的DNA可置于-20℃
保存。
6.3
PCR扩增
6.3.1引物：
Hi-F：5’-ACTTTTG