DB22_T1608-2012_牛病毒性腹泻_粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法_吉林省.docx
ICS65.020.30
B41
DB22
备案号：35742-2013
吉
林
省地方
标
准
DB22/T1608—2012
牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光
RT-PCR检测方法
Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBovineviraldiarrhea/mucosal
disease
吉林省质量技术监督局
发布
DB22/T1608—2012
前
言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。
本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局技术中心。
本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。
I
DB22/T1608—2012
牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（bovineviraldiarrhea/mucosaldisease，BVDV）荧光
RT-PCR检测方法。
本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverse
TranscriptionPolymeraseChainReaction）
采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5端非编码区最保守的核苷酸序列，设计
特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），
3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。
PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q
基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将
探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反
应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA
酶的容器分装。
1
DB22/T1608—2012
5.1.1水：配制方法见附录A.1。
5.1.2Catrimox-14(Cat-14)。
5.1.3酚。
5.1.4三氯甲烷。
5.1.5柠檬酸钠。
5.1.6正丁醇。
5.1.7乙酸钠。
5.1.8乙醇。
5.1.9异丙醇（-20℃预冷）。
5.1.10其他试剂：AMV反转录酶(5U/μL)、RnaseInhibitor(40U/μL)、10×AMVRTPCRbuffer、MgCL2(25
mM)、dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。
5.1.11引物：根据病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）国际标准株基因序列设计合成一对特异性引物：
上游引物5-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3，下游引物5-AACCACTGACGACTACCCTGTACT-3，TaqMan探
针（FAM）5-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3（TAMRA）均配制成20umol/L，-20℃保存。
5.2对照样品的制备
5.2.1阳性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按10%接
种原代牛睾丸细胞，于37℃吸附1h后加入维持液（见附录A.2），37℃培养，待CPE达到70%时
收获病毒悬液，冻融2次～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。
5.2.2阴性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融2次-3次，
5000r/min离心10min，取上清液备用。
6.1荧光PCR检测仪。
6.2高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。
6.6二氧化碳培养箱。
7.1.1组织样品：包括肠粘膜刮取物、肾、肝、肺、淋巴结、脾、胸腺。取2g-5g组织样品切成小
块，加5mL-15mL预冷的Hanks平衡盐溶液匀浆2min，制成悬液，4℃5000r/min离心取150μL
上清液加入1mLCat-14振荡混匀