DB13_T2456-2017_番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程_河北省.docx
ICS67.080.01
DB13
B31
河北省地方标准
DB13/T2456—2017
番茄苗期抗黄化曲叶病
毒基因快速检测技术规程
河北省质量技术监督局
发布
DB13/T2456—2017
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由河北省农林科学院提出。
本标准起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所。
本标准主要起草人：吴志明、李亚栋、耿保进、高慧敏、田玉、孙英焘、孙世卫、寇慧苹、冯贺
敬。
I
DB13/T2456—2017
番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程
1
范围
本标准规定了番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因的检测前准备和检测技术。
本标准适用于番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因Ty-1、Ty-2、Ty-3/3a的分子快速检测。
2
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
番茄黄化曲叶病毒病（Tomatoyellowleafcurlvirusdisease）
为病毒性病害，病原为番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCVorTY），
病原特征及发病症状见附录C。
2.2
番茄抗黄化曲叶病毒基因
2.2.1
3
组织研磨仪、恒温水浴锅、离心机、高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4℃、-20℃、-80℃)、
DNA提取液(CTAB)、氯仿/异戊醇(24/1)、乙醇、异丙醇、蒸馏水、双蒸馏水（ddH2O）、TE缓冲液
(Ph=8.0)、50xTAE缓冲液、Goldview、DM2000、琼脂糖、Taq酶等。
1
DB13/T2456—2017
表1给出了抗TYLCV的抗病基因扩增引物。
表1Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a检测引物
基因
染色体
引物
序列(5′-3′)
扩增产物(bp)
标记类型
Ty1正向
Ty1反向
Ty1-3
TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC
AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC
AAACGCTCTTCTTCCCCTCG
Ty-1
6
984（抗）
1434（感）
SNP
Ty1-4
AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA
AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC
AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC
GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC
Ty2正向
Ty2反向
Ty3正向
Ty3反向
Ty-2
11
6
194（抗）
494（感）
320（感）
SCAR
SCAR
Ty3450（抗）
Ty3a630（抗）
Ty-3/3a
3.4DNA提取液配制
配制以下DNA提取液：
a)100mmol/LTris(pH=8.0)；
b)50mmol/LEDTA；
e)0.8%皂土（W/V）。
4
d)6000rpm以上室温离心10min，吸取上清液400μL至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙
醇，上下颠倒混匀，室温静置5min；
e)10000rpm以上离心10min，弃上清液；
加入1ml70%乙醇洗涤，用手指轻弹使沉淀漂浮于乙醇中；
g)6000rpm以上离心5min，弃上清液，将离心管倒扣在滤纸上，风干DNA；
加入50μLTE缓冲液；
2
DB13/T2456—2017
i)
完全溶解后，取4μLDNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，剩下的置于-20℃或-80℃冰箱
中保存。
4.3Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a检测
4.3.1PCR检测反应体系
PCR反应液体积为20μL，组分配制应符合表2的规定。
表2PCR反应体系
反应组分
原浓度
终浓度
1.5ng/μL～2.5ng/μL
1×buffer
反应体积μL
DNA
10×buffer
dNTP
30ng/μL～50ng/μL
10×buffer
2.5mmol/L
5U/μL
1
2
0.15mmol/L
0.2U/μL
1.6
0.2
1
Taq酶
正向引物
反向引物
ddH2O
10μmol/L
10μmol/L
---
0.5μmol/L
0.5μmol/L
---
1
13.2
4.3.2Ty-1、Ty-2和Ty-3/3aPCR反应程序
a)94℃预变性5min；
b)94℃变性50s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共5个循环；
c)94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；
d)72℃延伸10min，4℃保存。
5
检测结论判定依据检测结