DB12_T1007—2020_茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程_天津市.docx
ICS65.020.01
DB12
B16
天津市地方标准
DB12/T1007—2020
茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技
术规程
Technicalregulationofdetectionfortomatoyellowleafcurlviruscarriedbyseeds
andseedlingsofsolanumfruitvegetables
天津市市场监督管理委员会
发布
DB12/T1007—2020
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。
本标准起草单位：天津市植物保护研究所。
本标准主要起草人：王勇、高苇、张春祥、杨利娟、刘晓琳、霍建飞、姚玉荣。
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DB12/T1007—2020
茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程
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范围
本标准规定了茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测的仪器和试剂、检测程序、结果判定、样品和
菌株保存。
本标准适用于农业生产中，茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒的检测。
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规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）适用于本文件。
GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法。
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术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟粉
虱以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是一类具有孪生颗粒形态的植物DNA病毒，广泛分布于
热带和亚热带地区，在烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等重要经济作物上造成毁灭性危害。番茄黄化曲
种苗传播病害seedling-bornedisease
种苗携带病原菌进行传播的一类植物病害。
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高速离心机、灭菌锅、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、旋涡振荡器、分析天平（感量1/10000g）。
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DB12/T1007—2020
4.2.3
商用植物DNA提取试剂盒或DNA提取试剂
DNA提取试剂主要有Lysis缓冲液和乙酸钾缓冲液。
4.2.4
裂解缓冲液
100mMTris-HCLpH8.0；50mMEDTA，pH8.0；1%SDS；10μg/mLRNaseA。
4.2.5
乙酸钾缓冲液
乙酸钾缓冲液3.0M，pH5.5。
4.2.6
凝胶电泳试剂
琼脂糖，TAEBuffer，核酸染料GoLdenview。
4.2.7PCR试剂
MasterMix。
5测试程序
5.1
检测样品
应以种子来源、育苗时间和育苗地点等相同的同一品种的种苗为一个种苗批次，每个种苗批不得大
于1万株，如果该批种苗标记或能明显地看出该批种苗在形态或文件记录上有异质性的证据时，应拒绝
取样。对一批种苗进行抽取样品时，按对角线五点、棋盘式或分层取样，每点取样10株～20株，取样应
有代表性。
将种苗样品均匀剪取植株茎尖和新叶幼嫩组织，加入石英砂后于低温条件下充分研磨，获得研磨组
病毒DNA的提取可以采用商用植物DNA提取试剂盒或DNA提取试剂，按照提取步骤和方法进行，或者
采用如下标准方法进行：
——从研磨组织物中收集20mg～100mg研磨组织，放置于1.5mL的离心管内（已经加入0.65mL的
Lysis缓冲液），搅拌均匀。每个离心管震荡30s，然后离心2min（12000rpm/min）；
——将0.5mL上清液转入一个新离心管中，加入100μL乙酸钾缓冲液（3.0M，pH5.5）。将离心管
反复倒置几次充分混匀后，再离心2min（12000rpm/min）；
——取0.5mL上清液转入一个新的离心管中（内含0.5mL异丙醇），将管内液体充分振荡后，离心
5min（12000rpm/min）。去除上清液后加入0.75mL的70%乙醇溶液，振荡后离心30s后去除
上清液，此步骤重复3次。最后去除上清液后，为DNA样品，将其置于无菌、通风干燥处30min
以上，让样品干燥后。将DNA溶解于10μL～200μLddH2O中。
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DB12/T1007—2020
对检测样本进行PCR检测，检测方法见附录B。采用番茄黄化曲叶病毒标准带毒组织DNA为阳性对照，
采用健康组织DNA为阴性对照，用灭菌ddH2O为空白对照，每样本重复3次。
5.2.4PCR产物序列分析
对种苗组织DNA进行PCR扩增，目的扩增片段为543bp，可对扩增产物双向测序，与GenBank中TYLCV
和GenBank中相关序列进行序列相似性比对分析，以验证样品种苗组织研磨物检测结果的准确性。
6结果判定
番茄黄化曲叶病毒的PCR检验结果判定的方法见附录