骨髓间充质干细胞外泌体piRNA-5900调控心肌细胞铁死亡减轻阿霉素诱导的心脏毒性.pdf

摘要

piRNA-5900

目的：

探究骨髓间充质干细胞外泌体（bonemarrowmesenchymalstemcell-derived

exosomes,BMSC-Exos）对阿霉素（doxorubicin,DOX）损伤心肌细胞的保护作用和

潜在分子机制，从而为阿霉素诱导的心脏毒性（doxorubicin-inducedcardiotoxicity,

DIC）提供新的治疗策略。

方法：

（1）体外构建DOX诱导的小鼠心肌细胞（HL-1s）铁死亡模型，分别设置

不同浓度梯度DOX（0μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM），处理时间24h，

定义为DOX组。通过CCK-8法检测细胞活力；Westernblot检测铁死亡相关蛋白谷

胱甘肽过氧化物酶4（glutathioneperoxidase,GPX4）、前列腺素内过氧化物合成酶

2（prostaglandin-endoperoxidesynthase2,PTGS2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成

员4（acyl-CoAsynthetases4,ACSL4）的表达水平。（2）根据（1）筛选出诱导HL-

1s发生铁死亡的最适DOX浓度，将浓度为50μg/mL的BMSC-Exos与DOX诱导的

心肌细胞共培养48小时，定义为外泌体共培养组（Bonemarrowmesenchymalstem

cell-derivedexosomescoculture,BEC）。通过CCK-8法检测心肌细胞活力，ROS实

验检测心肌细胞氧化应激水平，Westernblot技术检测铁死亡相关蛋白铁蛋白重链1

（ferritinheavychain1,FTH1）、转铁蛋白受体（Transferrinreceptor,TFRC）和

GPX4的表达水平（3）收集DOX组与BEC组心肌细胞，提取RNA后进行高通量

测序，采用生物信息学方法分别对两组心肌细胞内PIWI蛋白互相作用的RNAs

（PIWI-interactingRNAs，piRNAs）差异性进行分析，以差异倍数（FoldChange,

FC）≥0.5且P＜0.05作为差异性筛选标准；（4）通过基因本体论（GO）和京都基

因和基因组百科全书（KEGG）对差异性表达的piRNAs进行富集分析；（5）选取

BEC组较DOX差异最显著的6个piRNAs作为研究目标，采用实时荧光定量PCR

（QuantitativeReal-timePCR,RT-qPCR）对HL-1s中的piRNA进行验证；（6）在

HL-1s中分别转染piR-5900的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors）后用DOX

（2μM，24h）处理，通过RT-qPCR检测各组细胞转染效率，CCK-8法检测心肌细

胞活力，ROS实验检测心肌细胞氧化应激水平，Westernblot检测铁死亡相关蛋白

TFRC、FTH1、GPX4表达水平。（7）通过RNA下拉试验（RNApulldown）/LS-

I

青岛大学硕士学位论文

MS蛋白质谱分析确定piR-5900的下游靶基因和分子通路。

结果：

（1）HL-1s经2μMDOX处理24h处理后，细胞形态紊乱、活力显著降低，

铁死亡相关蛋白PTGS2、ACSL4表达明显增加，GPX4表达明显降低。（2）

BMSCs-Exos处理可以