骨髓间充质干细胞外泌体miR-223-3p靶向HDAC2下调STAT3磷酸化减轻HBx转基因小鼠足细.pdf

骨髓间充质干细胞外泌体miR-223-3p靶向HDAC2下调STAT3磷酸化

减轻HBx转基因小鼠足细胞铁死亡的机制研究

摘要

目的：

乙肝病毒相关性肾小球肾炎（hepatitisBvirusassociated-glomerulonephritis，

HBV-GN）是我国主要的继发性肾脏疾病之一，足细胞铁死亡参与HBV-X蛋白（HBx）

诱导的肾损伤，而骨髓间充质干细胞外泌体（BMSC-Exo）中的微小RNA（miRNA）

可以抑制这种损伤，但具体机制尚不清楚。本研究旨在探究BMSC-Exo中的miRNA

在HBx诱导足细胞铁死亡中的保护机制。

方法：

本研究通过在体外细胞实验和体内动物实验中过表达HBx基因来模拟HBV-GN

发病。体外实验使用人肾足细胞系（HPCs），转染HBx过表达慢病毒后获取HBx

稳转株；体内实验使用C57BL/6小鼠以及HBx转基因小鼠。首先通过体外给予信号

传感器和转录激活器3（STAT3）磷酸化抑制剂验证了STAT3磷酸化与铁死亡的关

系，以及体内外过表达组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）来验证HDAC2对STAT3磷

酸化的作用；接着通过超速离心法从骨髓间充质干细胞（BMSCs）中提取外泌体并

通过westernblot、透射电镜、免疫荧光对外泌体进行表征；最后通过体内外实验评

估含有miR-223-3p的BMSC-Exo在HBx诱导的HPCs铁死亡及损伤中与HDAC2、

STAT3磷酸化的相关性。通过RIP实验验证miR-223-3p与HDAC2之间的相互作用，

使用CCK8检测细胞活力，westernblot检测HDAC2、STAT3和p-STAT3的表达水

平，并使用免疫荧光检测HBx、GPX4、Nephrin以及Desmin的表达水平，使用流

式细胞术检测足细胞活性氧（ROS）的生成情况，丙二醛（MDA）含量检测试剂盒

和细胞铁含量检测试剂盒分别检测MDA和Fe2+的变化水平，使用RT-qPCR和

westernblot检测铁死亡相关基因SLC7A11、GPX4和ACSL4的表达水平，以及使

用HE染色和透射电镜分别观察HBx转基因小鼠肾脏和足细胞损伤情况，通过肌酐

测定试剂盒和尿素氮测试盒检测小鼠肌酐和尿素氮水平评估肾功能。

结果：

（1）HDAC2/p-STAT3通路在HBV-GN足细胞铁死亡中的作用：①转染HBx

后，HPCs细胞活力下降；Desmin表达升高，Nephrin表达下降，提示HPCs细胞损

伤；铁死亡相关基因GPX4、SLC7A11表达下降，ACSL4表达升高，ROS、Fe2+以

及MDA水平升高，提示HPCs细胞发生铁死亡；与此同时，HPCs细胞中p-STAT3

表达显著上调；而使用p-STAT3inhibitor后，抑制了p-STAT3的上调，HPCs细胞损

伤以及铁死亡程度减轻。②在HBx诱导的HPCs以及转基因小鼠肾脏中，过表达

HDAC2后，p-STAT3表达水平显著升高。

（2）BMSC-Exo中miR-223-3p减轻HBV-GN足细胞铁死亡的机制：①成功从

BMSCs中提取外泌体，westernblot显示BMSC-Exo高表达外泌体标志物CD9和

TSG101，呈圆形或椭圆形，且能够被足细胞摄取。②与转染空质粒组相比，在HBx

诱导的HPCs中过表达HDAC2后，细胞活力进一步下降，Desmin、ACSL4、ROS、

Fe2+和MDA表达升高，Nephrin、GPX4、SLC7A11表达下降，表明HDAC2加重了

HBx诱导的足细胞损伤和铁死亡；而给予BMSC-Exo处理后阻断了HDAC2的作用，

HDAC2表达下降，足细胞损伤和铁死亡程度减轻。③RIP法证明miR-223-3p能够

直接作用于HDAC2。④在转染HBx的HPCs中加入BMSC-Exo，抑制了HDAC2

和p-STAT3的表达，Nephrin、GPX4、SLC