目的基因的获得酵母双杂交.ppt

分析已知蛋白之间的相互作用对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱在药物设计中的应用六、酵母双杂交系统的应用现状第23页，共61页，星期日，2025年，2月5日1.利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。第24页，共61页，星期日，2025年，2月5日利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。2.利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用第25页，共61页，星期日，2025年，2月5日3.利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。第26页，共61页，星期日，2025年，2月5日4.利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。第27页，共61页，星期日，2025年，2月5日七、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施（一）假阳性较多（二）转化效率偏低（三）阴性干扰第28页，共61页，星期日，2025年，2月5日假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。（一）假阳性较多①BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。③AD融合蛋白直接与转录因子作用激活报告基因；④AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。原因：第29页，共61页，星期日，2025年，2月5日排除假阳性的措施①作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。②采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。③报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。④优化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。第30页，共61页，星期日，2025年，2月5日进一步分析：①这种相互作用是否会在细胞内自然发生。②有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。③一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。排除假阳性的措施第31页，共61页，星期日，2025年，2月5日原因：由于酵母转化效率较细菌低4个数量级，因此转化成为双杂交技术的重要瓶颈。解决办法：引进酵母接合型a接合型和?接合型（两者之间可形成二倍体，但自身不能）（二）转化效率偏低第32页，共61页，星期日，2025年，2月5日?接合型酵母细胞cDNA文库诱铒蛋白基因多克隆位点DNA-BD载体AD载体转化转化a接合型酵母细胞筛选平板生长菌苔筛选平板生长菌苔同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定β-半乳糖苷酶部分已商品化第33页，共61页，星期日，2025年，2月5日（三）阴性干扰融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。两个蛋白本应发生相互作用，但