叶部病害分离.ppt

实验三 叶部病原真菌的分离、培养、纯化 柯氏准则： 这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往往就有这种微生物的存在； 从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可以在各种培养基上研究它的性状； 将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发与原来相同的病害； 从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。 一、实验目的 为了证实其病原菌的特性； 为了进一步研究病原菌的形态、生活史、生理和生态特性； 为了获得其发酵液等 鉴于以上原因，分离和纯化真菌是必需的，是保证整个实验能够顺利进行的前提。 二、实验原理 真菌的分离就是将所需要的真菌与其他杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。 为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯培养菌株。 三、实验步骤 分离前的准备工作 （1）工作台的灭菌 （2）培养基的准备 （3）操作人员的清洁 （4）分离所需用具的消毒与灭菌 培养皿、小烧杯、接种针、酒精灯、解剖刀、剪刀、纱布、记号笔、镊子、酒精、培养基、 表面消毒液 2. 分离材料的选择 （1）必需是新鲜发病的植株、器官或组织 （2）选择的组织必需是病健交界的部位 原因：主要是尽量减少腐生菌的污染 3. 组织的表面消毒 （1）升汞溶液：一般用0.1％的升汞溶液；升汞表面消毒所需 的时间因材料不同，处理的时间可自30s－30min不等，通常为3－5min。（现在不用） （2）次氯酸钠：所用的浓度一般每一次使用的是3％－5％的水溶液，消毒时间为5－15min。 （3）酒精：常用浓度70％酒精。消毒时间一般很短，只有几秒钟至1min。 4. 一般分离方法 病原真菌种类繁多，其分离的方法不同，而同一种材料又可用不同的方法分离。常用的方法可分为两大类，即组织分离和稀释分离法。 （1）组织分离法 植物病原真菌（尤其是叶部病害）的分离一般都是用组织分离法，即就是切取小块病组织，经表面消毒和无菌水洗过之后，移在培养基平板上培养。 注意事项： ① 组织大小要适宜，一般为4－5mm的小块。 ② 切取的组织块必需是病健交界的部位。 ③ 要掌握消毒时间的长短。 （2）稀释分离法 植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分离，但对于一些产孢子量极大的病原真菌和霉菌，可以配制成孢子悬浮液进行稀释分离。 具体步骤：将寄主组织受害部分的孢子洗下配成悬浮液，经稀释后与熔化并冷却到45度左右的培养基混合，然后倒在灭菌的培养皿中。 注意事项： ① 待分离组织必需是新鲜发病的。 ② 要掌握培养基的温度。 ③ 要掌握孢子悬浮液的浓度。 （3）细菌污染的排除 在分离过程中，由于细菌生长繁殖速度快于真菌，是获得病原真菌纯培养最大的障碍。因此，在分离过程中，常采用一些方法来抑制细菌的生长，从而保证能够获得目的菌株。 ① 将培养基调节到酸性反应，在100mL培养基中加3滴25％的乳酸。 ② 培养基中加入适当的抗菌素，以抑制细菌的生长。 常用的抗菌素： 金霉素：浓度为30μg/mL，可以抑制多数细菌的生长； 青霉素：浓度为20μg/mL，可以抑制革兰氏反应阳性细菌的生长； 多粘霉素： 浓度为5μg/mL，可以抑制革兰氏反应阴性细菌的生长； 链霉素：浓度为40μg/mL，可以抑制大部分细菌的生长； 氯霉素：浓度为50μg/mL，可以抑制大部分细菌的生长。 使用方法：除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后并冷却至45℃左右时加入。 ③ 双层培养基法 真菌菌丝体能够穿透培养基，而细菌则没有这种能力。 5. 真菌培养性状的观察 培养真菌的目的主要是观察它的性状；研究环境条件对它的影响；了解其生理生化特性。 （1）培养性状的观察：观察和描述真菌的性状最好是培养在琼胶培养基上。 观察和记载的项目主要是： ① 菌落的质地；② 菌落形成是凸起的或者是有成簇的菌丝体；③ 形成成堆的孢子是干的还是粘性的；④ 各种子实体和休眠结构的形成和所需的时间；⑤ 菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培养基中；⑥ 有无特殊气味；⑦ 菌落中有没有部分呈扇状；⑧ 生长率的快慢。 注意事项： ① 培养性状的观察与描述需要不断的观察，有一定的时间延续性； ② 最好选用多种培养基； ③ 培养性状的描述要注明培养基的种类、培养温度和有无光照等。 （2）生长量的测定 为了研究真菌的营养要求和环境影响，必需知道他们的生长率。 在一定时间内菌丝体增长的量，