2025年高通量测序：环境微生物群落多样性分析.doc
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析
微生物群落多样性的基本概念
环境中微生物的群落构造及多样性和微生物的功能及代謝机理是微生物生态學的研究热點。長期以来，由于受到技术限制，對微生物群落构造和多样性的认识還不全面，對微生物功能及代謝机理方面理解的也很少。但伴随高通量测序、基因芯片等新技术的不停更新，微生物分子生态學的研究措施和研究途径也在不停变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche
454高通量测序技术）的成熟和普及，使我們可以對环境微生物進行深度测序，敏捷地探测出环境微生物群落构造随外界环境的变化而发生的极其微弱的变化，對于我們研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的运用以及人类醫疗健康有著重要的理论和現实意义。
在国内，微生物多样性的研究波及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体醫學等诸多领域。以在醫疗领域的应用為例，通過比较正常和疾病状态下或疾病不一样進程中人体微生物群落的构造和功能变化，可以對正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性進行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通過深度测序還可以迅速地发現和检测常見病原及新发传染病病原微生物。研究措施進展
环境微生物多样性的研究措施诸多，從国内外目前采用的措施来看大体上包括如下四类：老式的微生物平板纯培养措施、微平板分析措施、磷脂脂肪酸法以及分子生物學措施等等。
近几年，伴随分子生物學的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，為微生物分子生态學的研究方略注入了新的力量。
目前用于研究微生物多样性的分子生物學技术重要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其试验成果中往往只具有数拾条条带，只能反应出样品中少数优势菌的信息；另首先，由于辨别率的误差，部分電泳条带中也許包括不只一种16S
rDNA序列，因此要获悉電泳图谱中详细的菌种信息，還需對每一条带构建克隆文库，并筛选克隆進行测序，此试验操作相對繁琐；此外，采用這种措施無法對样品中的微生物做到绝對定量。生物芯片是通過固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只能验证已知，却無法探索未知”，此措施通過信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的精确。
而近年来以454焦磷酸测序為代表的高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自動化的优势為研究微生物群落构造提供了新的技术平台。Roche
454高通量测序技术能同步對样品中的优势物种、稀有物种及某些未知的物种進行检测，获得样品中的微生物群落构成，并将其含量進行数字化。近来，美吉生物推出了新的测序平台———MiSeq。MiSeq高通量测序平台集中了Roche
454和IlluminaHiSeq
2500的長处，不仅可实現對多样品的多种可变区同步测序，并且在测序速度和测序通量上均有深入提高，目前此平台已在微生物多样性群落构造研究方面受到了广大學者的承认。第二代高通量测序技术
产品优势
無需培养分离菌群：
直接從环境样本中扩增核糖体RNA
高变区進行测序，处理了大部分菌株不可培养的难題。
客观還原菌群构造：
专业、成熟、稳定的样本制备流程，严格控制PCR
循环数，客观還原样品自身的菌群构造及丰度比例。
痕量菌检测：
充足发挥高通量测序的大数据量优势，能检测出丰度低至萬分之一的痕量菌。生信分析
1.稀释性曲线（RarefactionCurve）采用對测序序列進行随机抽样的措施，以抽到的序列数与它們所能代表OTU的数目构建曲线，即稀释性曲线。
當曲线趋于平坦時，阐明测序数据量合理，更多的数据量對发現新OTU的边际奉献很小；反之则表明继续测序還也許产生较多新的OTU。
横轴：從某個样品中随机抽取的测序条数；Label0.03
表达该分析是基于OTU序列差异水平在0.03，即相似度為97%的水平上進行运算的，客户可以选用其他不一样的相似度水平。
纵轴：基于该测序条数能构建的OTU数量。
曲线解讀：
?图1中每条曲线代表一种样品，用不一样颜色標识；
?
随测序深度增長，被发現OTU的数量增長。當曲线趋于平缓時表达此時的测序数据量较為合理。
2.Shannon-Wiener
曲线
反应样品中微生物多样性的指数，运用各样品的测序量在不一样测序深度時的微生物多样性指数构建曲线，以此反应各样本在不一样测序数量時的微生物多样性。
當曲线趋向平坦時，阐明测序数据量足够大，可以反应样品中绝大多数的微生物物种信息。
横轴：從某個样品中随机抽取的测序条数。
纵轴：Shannon-Wiener指数，用来估算群落多样性的高下。
Shannon指数计算公式：
其中，
Sobs=实际测量出的OTU数目；
ni=具有i条序列的OTU数目；
N=所有的序列数。