载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定.pdf

实验一载体与目的基因的连接与转化以及

重组DNA的提取与酶切鉴定

一、实验目的

1.CaCl法制备感受态细胞

2

目的基因与载体连接（；粘端连接）

2.c-myc+pSV2

3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Ampr）

4.质粒DNA的小量快速制备

5.质粒DNA的限制性内切酶酶切

6.DNA的琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理

通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对

氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组

的DNA分子。

受体细胞经处理后（电击或CaCl等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使

2

外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程

称为转化。由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含

氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。

分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离

和纯化质粒DNA。SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用

染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH12.6时，染色体

DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结

构，两条互补链不会完全分离。当采用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性

时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。

通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。

三、实验器材和试剂

1.器材

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋

振荡器、移液枪及枪头、1.5ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、

电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。。

试剂

2.

)用和处理的线状质粒()

1BamHIXbaIpSVDNA20ng/ul

)用和处理的片段()

2BamHIXbaI4.8kbc-mycDNA20ng/ul

)已连接好目的片段的重组质粒()

3c-mycpSVDNA5ng/ul

连接酶()及X连接酶缓冲液(公司)

4)T4DNA5U/ul10Thermo

5)LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板(含抗生素)

6)0.1mol/LCaCl/溶液

质粒小量试剂盒(公司产品)

7)AxyPrepDNAAxygen

8)无水乙醇

9)BamHI(10ug/ul)及XbalI(10ug/ul)(NEB公司产品)

X(公司产品)

10)10Buffer4NEB

X(乙酸；)

11)1TAE0.04mol/LTris-0.001mol/LEDTA

()(公司)