实验汇报(提总RNA及RT-PCR)--叶跃天.ppt

点 样 生物体内一般含有核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转运RNA(tRNA)三种主要的RNA,其中rRNA含量最多,提取组织总RNA所得最多的就是rRNA.真核生物中含有5S、5.8S、18S、28S,原核生物中有5S、16S、23S；而植物组织中一般较多的为5S、18S、28S。S代表沉降系数,当用超速离心测定一个粒子的沉降速度时,此速度与粒子的大小直接成比例。5S、18S、28S分别具有120、1900和4700个核苷酸。 原理: 酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同. 结构： 规格有24孔板，48孔板，96孔板等多种，不同的仪器选用不同规格的孔板，对其可进行一孔一孔地检测或一排一排地检测. 用途： 可广泛应用于低紫外区的DNA、RNA定量及纯度分析（A260/A280）和蛋白定量（A280/BCA/Braflod/Lowery），酶活、酶动力学检测，酶联免疫测定（ELISAs），细胞增殖与毒性分析，细胞凋亡检测（MTT），报告基因检测及G蛋白偶联受体分析（GPCR）等 ······ 酶标仪 Trizol法提总RNA 及RT-PCR技术 Trizol法提总RNA Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。 实验原理 一、实验准备 仪器：离心机、恒温箱、涡旋仪、酶标仪、水浴锅、PCR仪、上样电泳仪、电子天平等 工具: 泡沫盒、手套（线、乳胶、塑料薄膜）、EP管、研钵、多型号微量移液器、RNA专用枪头、试管、量筒等。 试剂: 液氮、无水乙醇、DEPC水（焦磷酸二乙酯：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性）、TRI-ZOL、氯仿、异丙醇、核酸胶（琼脂粉、TAE缓冲液、EB）、Loading buffer（上样缓冲液）、Marker（分子标记）、反转录引物、反转录试剂盒、PCR试剂盒等。 样本：根据实验要求取样。 二、注意事项 (一)试验中会遇到有毒有害试剂，所以在试验中务必遵守实验规程，带好手套及口罩，勿随手触摸试剂等。 (二)RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。 1、人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。 2、实验所用枪头、EP管须在DEPC水中过夜浸泡，取出后放 在高压蒸汽灭菌箱内处理，121℃、30分钟。 3、研钵洗净后放在鼓风干燥箱内处理，180℃、6小时。取出后冷凉，再放入-80℃冰箱中预冷。 4、实验开始之前要先将37℃恒温箱打开。同时打开水浴锅，温度分别调到65℃和42℃。 三、试验流程 取材：取少量液氮于泡沫盒中，从-80℃冰箱中取出样本、研钵、研磨棒。样品投入液氮中。 配置裂解液：取8支EP（标记，以后做转移时都要标记），各加1ml Tri-zol+10ul 蛋白酶水。 研磨：用镊子取适量样品与研钵中研磨，研磨过程中不断添加液氮（防止化冻，内源性RNA酶降解RNA）。研磨充分后用枪头尽可能快地将样品转入事先准备好的裂解液中，剧烈震荡。 静置15min。 三氯甲烷：向8支EP管中各加200ul三氯甲烷（枪头悬空加，不用换），充分混匀后，静置15min。 离心：15min后，12000rpm-4℃-15min 异丙醇：离心完成后，吸出上清转移至另8支EP中，再加入500ul异丙醇（沉淀RNA），静置10min。 离心：10min后，12000rpm-4℃-10min 离心完成后，倒掉上清，向各管中加入1ml 75%乙醇。 直接离心，10000rpm-5min 离心后，倒掉上清，稍微离心，取出，用虹吸的方法洗出残留的乙醇。晾置10min。 当RNA边缘约1/3开始透明时，加适量DEPC水（一般约20-30ul），RNA较多时可加35-40ul。 37℃恒温箱中，30min。 RNA提取结果的鉴定 1、将恒温箱中的RNA取出，轻轻吹打，并转移至另8支EP（作详细编号，eg：热对1-1,2013.11.9） 2、从上述含有RNA的EP中各取3ul，放到酶标仪的板上（加一组DEPC水作为对照） 3、测吸光度：设定在230nm、260nm、280nm处的吸光度。设置预计算，计算A260/A280是否在1