rt-pcr原理与实验操作_百替生物.pdf

RT-PCR 原理与实验操作 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白mRNA （每个mRNA 存 活4d ，可以合成105 个丝心蛋白） 共合成 109 个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA 表达水平对 于其功能水平的调控是非常重要的。 2 、PCR 技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工 合成的引物序列决定。反应分三步： A 、变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA ； B 、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA 聚合酶和dNTPs 及Mg2 ＋存在下，退火引物沿5 ‘3 ’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase ）是存在于RNA 病毒体内的依赖RNA 的DNA 聚合酶，至少具有以下 三种活性： 1、依赖RNA 的DNA 聚合酶活性：以RNA 为模板合成cDNA 第一条链； 2 、Rnase 水解活性：水解RNANA 杂合体中的RNA ； 3、依赖DNA 的DNA 聚合酶活性：以第一条DNA 链为模板合成互补的双链cDNA. 二、RT-PCR 的准备： 1、引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。 在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA 剪切方式以及 可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白 表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2 ）引物设计原则的把握：引物设计原则包括 a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR 的特异性，引物太长PCR 的最适延伸温度会超 过Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3 个以上的单 一碱基。GC 含量（Tm 值）：40 ％～60 ％，PCR 扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10 度。 c、 3 ‘端要求：3 ’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。 末位碱基是A 时错配的引发效率最低，G、C 居中间，因此引物的3 ’端最好选用A 、G、C 而尽可能 避免连续出现两个以上的T 。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4 个连续碱基互补，3 ’端不应超过2 个。 f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8 个的互补碱基存在。 g、5 ’端无严格限制：5 ’末端碱基可以游离，但最好是G 或C，使PCR 产物的末端结合稳定。还可 以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0 ，Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行 设置。 2 、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP 管之类事先都需经过0.1%DEPC 水浸泡处 理，除去RNA 酶，防止操作过程中RNA 降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC ）。 3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC 处理并高压的水。 service@100 三、RNA 的提取方法： RT －PCR 中从细胞分离的RNA 的质量至关重要，包括RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的最关 键因素是尽量减少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外， 环境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源 性RNA 酶污染和抑制内源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC ）去除外源性RNA 酶， 通过RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。 实验操作步骤 一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200 μl、20 μl、10 μl、2 μl 2 、吸头：