第5组短命植物对盐胁迫的生理响应研究.ppt

短命植物对盐胁迫的生理响应 组长：吴凯凯 组员：张玲、杨春艳、 禹飞雄、翟鹏飞 过氧化物酶活性的测定 一、实验目的 过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酶类物质代谢，植物抗性密切相关。通过实验掌握提取POD和测定其活性方法和原理。 二、实验原理 过氧化物酶催化H2O2氧化酶类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深产物。本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，次产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸收光度变化得知过氧化物酶的活性。 三、材料与试剂及仪器 材料：马铃薯 试剂：20m mol/L KH2PO4,反应混合液 仪器：分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管， 离心机。 四、方法步骤： 1、 酶液制备：称取材料1.079g，加入20m mol/L KH2PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆，在 3000r/min，下离心10min,上清液转入25ml,容量瓶，残渣再用5ml, KH2PO4,提取一次，定容，混匀，贮于冷凉处备用。 （反应混合液： 100 mol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。） 疑问为什么制备方法不一样 2、 比色测定：光径1cm比色杯两只，1只先加1ml KH2PO4，再加3ml混合液作参比液； 另一只加1ml,酶液，3ml混合液，立即计时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测8min，每次测定前重新对照校准。 五、实验结果 吸光度变化值ΔA= A2-A1 V1——提取酶液的总量 V2——测定取酶液的量 酶活力（0.01 A470/L）=(A2-A1)/0.01(t2-t1)*(V2/V1) =328.2μ 酶的比活力（μ/g） =酶活力/样品重 =304.2μ/g 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法） 一、实验目的 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 二、原理 过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。 三、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：小麦叶片?? （二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水 浴；5. 容量瓶。 （三）试剂： 1. 10%H2SO4； 2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液； 3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g， 用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液 标定； 4. 0.1mol/L H2O2（30%H2O2大约等于17.6mol/L）取30%H2O2 溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。 四、实验步骤 1. 酶液提取： 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心。 （上清液即为过氧化氢酶粗提液） 2. 取50ml三角瓶4个 （两个测定两个对照） ， 测定加入酶液2.5ml， 对照为煮死酶液2.5ml； 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2，同时计时间，于30℃恒温水浴中保温10分钟，立即加入10％H2SO4 2.5ml。 3. 用0.1mol/l KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。 五、结果计算 酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示： 酶活（酶分解的H2O2 mg/g鲜