抗体产生过程中dna脱甲基化对抗体基因的影响.ppt

抗体产生过程中DNA脱甲基化对抗体基因的影响 姓名 熊玉林 导师 孟春 副教授 研究背景及主要内容 * * 明德至诚 博学远志 研究背景及内容 1 实验材料与方法 结果与讨论 1 2 3 免疫球蛋白基因及抗体多样性 4 250 1.0×103 V-J J V L链 4 12 1000 4.8×107 4.8×104 V-D-J J D V H链 H链和κ链相互随机配对后*推算的多样性数目 H链和L链重排所推算的多样性数目 V区基因重组方式 基因片段数 多肽链 DNA甲基化及其生物学意义 1950年，科学家就发现了DNA甲基化现象，但直到1988年Bester等发现了编码DNA甲基化的基因和甲基转移酶，有关DNA甲基化的研究才慢慢开展起来，但主要集中在探讨癌症及肿瘤与DNA甲基化之间的联系。 DNMT 在细胞发育和分化过程中调节基因的表达 DNA甲基化功能 中和潜在危险的DNA序列 DNA脱甲基化和免疫系统 实验材料与方法 模型一 A组：空白 B组：一次免疫 C组：二次免疫 D组：空白 +5-Aza E组：一次免疫+5-Aza F组：二次免疫+5-Aza 模型二 A组：抗原 B组：抗原+佐剂 C组：抗原 +5-Aza D组：抗原+佐剂+5-Aza 局部甲基化程度检测——亚硫酸盐修饰法 DNA经亚硫酸氢钠修饰后C会变成U，而DNA甲基化后，带有-CH3的C不被修饰。而A和T（U）的退火温度比C和G的退火温度低2℃。因此，甲基化程度低的目的片段的Tm值较低。 整体甲基化程度检测——甲基化敏感性酶切法 BamHⅠ CCTAGG MSCⅠ TGGCCA HpaⅡ CCGG CH3 HpaⅡ CH3 PCR HpaⅡ PCR V(D)J重排检测 引物设计 VH DH JH1 JH3 JH2 JH4 Vκ Jκ1 Jκ4 Jκ2 Jκ5 H链 κ链 结果与讨论 一、抗体效价测定 二、抗体基因启动子区甲基化程度检测 体外实验 H链 κ链 体内实验 κ链 H链 三、抗体基因整体甲基化检测 体外实验 体内实验 四、抗体基因可变区突变检测 T→G 319 T→G 319 A→G 281 A→G 281 T→A 83 G→T 145 A→G 79 A缺失 135 T→G 319 无 A→G 78 T缺失 128 F T→G 319 T→G 319 A→G 281 T→G 319 A→G 281 T缺失 83 A→G 79 A→G 281 A→G 281 A→C 80 A→C 78 E T→G 319 T→G 319 T→A 83 T→G 319 A→G 79 A→G 281 A→G 281 A→G 78 A→G 281 D G缺失 301 A→G 281 A→C 356 无 C→T 35 C T→G 319 T→G 319 无 无 A→G 281 A→G 281 B T→G 319 T→G 319 T→G 319 A→G 281 A→G 281 A→G 281 A→G 281 A 突变类型 位置 突变类型 位置 突变类型 位置 突变类型 位置 编号 脾细胞加入5-Aza培养48h 脾细胞加入5-Aza培养24h 脾细胞 体细胞 G→A 87 T→C 318 T→C 318 T→G 306 T缺失 306 C→T 102 C→T 102 G→A 87 G→A 87 A→G 69 G→A 87 A→G 69 A→G 69 F C→T 102 C缺失 374 G→A 87 C→T 102 G→A 87 C→G 318 C→G 298 T→A 306 T→A 293 A→G 69 A→G 69 C→T 102 C→T 102 E C→T 102 C缺失 374 T→C 318 C→T 102 G→A 87 C→T 102 T→G 306 G→A 87 C→T 102 G→A 87 A→G 69 A→G 69 A→G 69 C→A 95 D C缺失 374 添加G 376 C→T 102 C缺失 374 G→A 87 C→T 102 G→A 87 A→G 69 A→G 69 无 T→G 306 C C→T 102 C缺失 374 G→A 87 C→T 102 G→A 87 A→G 69 A→G 69 无 无 B C→T 102 C→T 102 T→C 318 G→A 87 G→A 87 T缺失 306 C→T 102 G→A 87 A→G 69 A→G 69 A→G 69 C→T 102 A 突变类型 位置 突变类型 位置 突变类型 位置 突变类型 位置 编号 脾细胞加入5-Aza培养48h 脾细胞加入5-Aza培养24h 脾细胞 体细胞 五