人工合成细胞Science2010年.doc

创建由化学合成的基因组控制的细菌细胞 摘要： 我们报道了根据基因组测序结果来设计、合成并装配一个1.08MMb的支原体Mycoplasma mycoides JCV1syn1.0 的基因组，然后把这个基因组移植进入一个支原体M. capricolum受体细胞中，产生了一个仅由合成的基因组控制的新的Mycoplasma mycoides细胞。在这个细胞中唯一的DNA就是我们设计合成的DNA序列，上面包括“水印序列”（Watermark）和其他一些设计进去的基因缺失和多态性以及在基因组构建过程中带进去的突变。这个新的细胞已经呈现出我们预期的表型，而且能够进行连续的复制（增殖）。 1977年，Sanger和同事测定了噬菌体?X174的完整的遗传序列【1】，这是第一个被完全测序的DNA基因组。18年后，也就是在1995年，我们团队解读了第一个完整的自我复制的细菌流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的遗传序列【2】。在这些最初的研究的基础上，对多物种的基因组序列进行解读已经成指数般快速发展起来。在过去的25年中，快速对基因组测序的能力已经增长了逾8个数量级【3】。随着对所有这些新的基因组信息的理解和探究，催生了大量新的计算机模拟以及实验研究方面的范例（指著名的研究成果），但是我们对基因组的了解仍然是十分有限。就生物学功能而言，还没有任何一个细胞系统中的基因能够被我们全部理解。即便是在一个单细胞细菌中，它的染色体就包含了遗传需要的所有信息吗？如果这样，一个完整的遗传系统能够通过化学合成的方法根据计算机中测定好的DNA序列信息来起始合成吗？ 我们对大DNA分子和染色体的合成的兴趣萌生于我们在过去的15年中努力去构建一个仅含有必须基因的最小细胞。这项工作在1995年就已经开展，当时我们测序了生殖支原体Mycoplasm genitalium的基因组。 M. genitalium是一种目前已知的能够在实验室独立生长的拥有最小基因组的细菌。当我们一次失活一个基因进行研究，发现在该M. genitalium的485个编码蛋白质的基因中有超过100个基因都是非必须的【4-6】。 我们发展了一种通过把病毒粒子大小的片段组装成大分子DNA的策略，这样使我们能够在4个阶段把化学合成的平均6kb大小的一些DNA区段（cassette)组装成人工合成的M. genitalium基因组。这是通过体外酶学以及酵母菌体内重组相结合的方法来完成的。这个完全人工合成的基因组（含582970碱基对）作为一个酵母着丝粒质粒（YCp）可以稳定地在酵母细胞中生长【7】。 在移植一个化学合成基因组进入受体细胞并进行表达的过程中遇到的一些难题已经被我们克服了。我们现在需要改进从酵母体内提取完整的基因组的方法，同时需要掌握如何把这些基因组转入受体菌细胞来构建一个完全由合成基因组控制的细胞。基于M. genitalium生长速率过慢，我们想到了两种快速生长的支原体，即M. mycoides的亚种capri (GM12)作为供体（提供基因组信息），而M.capricolum的亚种capricolum (CK)作为受体（去除自身基因组后，接收合成的基因组）。 为从酵母体内移植出合成基因组创造条件和流程，我们发展出把作为酵母菌着丝粒质粒的整个细菌染色体进行克隆的方法，包括克隆了M.mycoides天然的基因组【8，9】。然而，起先将M. mycoides的基因组从酵母中提取出来进而移植入M. capricolum的尝试失败了。我们发现供体和受体支原体利用相同一套限制系统。供体细胞基因组在天然的M. mycoides细胞中被甲基化，所以在从这个供体细胞中提取基因组并进行移植入受体的过程中，移植的基因组因甲基化保护免遭受体细胞限制性酶系的破环【10】。但是，生长于酵母中的细菌基因组没有被甲基化，因此在遭遇受体细胞中的限制系统的限制时不会受到保护。我们就用纯化的甲基化酶或M. mycoides提取物亦或M. capricolum提取物使供体DNA基因组先甲基化，或者干脆破坏掉受体细胞的限制系统以克服这一限制系障【8】。 我们现在已经把原先建立起来的程序进行了组合，在这里报道我们通过合成、组装、克隆一个1.08-Mb的基因组（命名为M.mycoidesJCVI-syn1.0基因组）并进行成功移植，从而创造了一个由合成基因组所控制的新细胞。 1合成基因组的设计 M. Mycoides JCVI-syn1.0基因组的设计是在M. mycoides亚种capri GM12【8，9，11】的两种试验用菌株基因组序列被高度精确测定的基础上进行的：一个是被L