异源表达系统中蛋白质糖基化.doc

异源表达系统中蛋白质糖基化 许　强　王克夷 (中国科学院上海生物化学研究所，上海 200031) 　　摘要　糖基化作为真核细胞中最为广泛的蛋白翻译后修饰方式，对糖蛋白的分泌、抗原性、代谢等有重要的作用。大多数药用蛋白均为糖蛋白。近年来，在糖生物学功能的研究，糖形的精确分析，以及糖基化生物合成的调控等方面，人们已取得巨大进步。本文主要探讨了不同异源表达系统中糖基化的优缺点。　　　 关键词　　糖基化；表达系统 　　糖基化作为真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，有其重要的生物学意义。虽然不同糖蛋白中糖链的功能是不同的，但是由于糖链能修饰并改变蛋白质的内在特性，从而对糖蛋白整体生物学功能的体现至关重要［1］。另一方面，基因工程技术的飞速发展，使人们有可能通过改变基因，来得到人们所需求的产品。目前，已有许多重组蛋白作为药物用于临床，然而绝大多数此类药用蛋白在天然状态下为糖蛋白，或为在体内发挥药效必须被糖基化。另外，为确保药物产品的安全性、药效和均一性，研究和监控药用重组糖蛋白的糖基化形式也是必不可少的。事实上，美国食品和药物管理局(FDA)已经要求在申报人用糖蛋白类药物时，须提供糖蛋白表面复杂糖形的分析结果［2］。　　重组糖蛋白在异源系统中表达，虽用基因工程手段可直接改变蛋白质部分的性质，然而由表达系统提供最优或最“忠实”反映药用糖蛋白糖形，则是一极其复杂的问题。在许多情况下，没有足够量的天然糖蛋白用于糖链结构的分析，此问题就显得尤其突出。糖链的合成与肽链是不同的，其合成是由糖基接受体、糖基供体和糖基转移酶三者协调完成。其中，糖基转移酶又居主导地位。因此，每一条糖链为一组糖基转移酶的催化产物，而一组酶又为一群基因的编码产物，也即糖链同基因并非直接对应关系，故无法利用“模板”来推导糖链中糖基的顺序。另外，糖链又存在着不均一性，大多数情况下，这种不均一性反映了组织、细胞类型、发育和分化阶段的不同；而培养条件(如培养基的组成)、下游加工过程中降解等因素，进一步导致了糖基化形式的多样性［3］。因而，研究不同表达系统和细胞培养条件等因素对糖基化的影响，就显得极其重要。 1　糖链的生物学功能 　　近年来，随着糖链结构与功能研究的进展，人们对糖链生物学功能的了解越来越深入。例如，糖链能阻止基因工程表达的糖蛋白产物的聚集：在真核细胞中表达的产物因带有复杂型(如哺乳动物细胞产物)或高甘露糖型(如酵母细胞产物)糖链，蛋白可不发生聚合而分泌出细胞外；而在缺乏糖基化体系的大肠杆菌中表达的非糖基化蛋白，则常聚集成不溶性包涵体形式存在，很少分泌出细胞，所以糖蛋白表面的糖链有助于蛋白质的溶解，防止肽链聚集的作用。又如，促红细胞生成素(EPO)的天然来源十分有限，目前大多用基因工程的方法生产。从人尿中提取的天然EPO在Asn24、Asn38和Asn83上各有一条N-糖链，且为四天线和部分三天线的复杂型N-糖链。通过基因重组表达的EPO(rhEPO)，若NeuAc完全或部分去除后，在体内能很快地被肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体摄取，故而在体内几乎不体现活性，可见NeuAc对EPO在体内的半衰期影响极大。另外，由某种中国仓鼠卵细胞(CHO)表达的二天线糖链的hEPO，即使糖链末端被唾液酸化，在体内的活性仍极弱，远远低于四天线糖链的天然hEPO［4］。因为多分支结构的糖链可能参与防止小分子量糖蛋白渗出肾脏，或是作为从生成器官肾脏到骨髓靶细胞间的“归巢”信号。由此，可对治疗用糖蛋白生产得到如下启示：末端糖基和糖链的分支结构，能显著地影响糖蛋白的体内生物学活性和半衰期；而两者均可由宿主细胞选择来决定，但糖链的分支结构还可能依赖于蛋白的序列。所以，精心选择表达系统及严格控制培养条件，是保证重组糖蛋白体内活性的关键因素。　　根据已有实验证据来看，糖链影响糖蛋白的生物学功能，主要体现在以下方面：(1)分子内：影响蛋白质的正确折叠、聚合，细胞内定位，蛋白的生物活性，溶解度，免疫原性，生物半衰期，及对蛋白酶作用的抗性等；(2)分子间：参与细胞内转运、定位，细胞间识别、粘附，与病原体的结合等。 2　影响蛋白糖基化的因素 　　细胞中的蛋白质，即使经历相同的糖基化机制和分泌途径，也并非所有的潜在位点均可被糖基化，据估计有10%～30%的潜在糖基化位点不能糖基化。实验进一步表明，不同类型N-糖链的分布也存在着糖基化位点的专一性。如鼠脑Thy-1蛋白，其Asn23仅能为高甘露糖型糖链，Asn74可为杂合型或复杂型糖链，而Asn98则能为任一种N-糖链［5］。因此生物体内的确存在某些因素控制着蛋白质的糖基化，包括：(1)蛋白质的氨基酸序列决定着潜在糖基化位点的分布和数目。例如，EGF模体(motif)中恒定序列GGS/T常能被O-岩藻糖基化。(2)在糖蛋白的生物合成过程中，糖蛋白的折叠方