第二章细胞生物学的研究技术和方法.ppt
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第二章 细胞生物学实验技术和方法;—、光学显微镜
(一)普通光学显微镜
1. 构成:
①照明系统
②光学放大系统
③机械装置
2. 原理:经物镜形成倒立实像,经目镜放大成虚像。;;显微镜的结构;显微镜的光路
; 3. 分辨力:指分辨物体最小间隔的能力。
光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N.A.
其中λ为入射光线波长;
N.A.为镜口率 =nsinα/2;
n=介质折射率;
α=镜口角(样品对物镜镜口的张角) 。
光镜分辨力约为0.2μm,人眼的分辨力为0.2mm,显微镜的最大有效倍数为1000X。;表一、几种介质的折射率; 显微镜的几个光学特点:
介质折射率越接近镜头玻璃的( 1. 7 )越好;
sin α /2的最大值小于1;镜口率最大约1.6;
普通光线的波长为400~700nm,;(二)荧光显微镜 Fluorescence microscope;Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green;(三)激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;laser confocal scanning microscope, LCSM;;LCSM Image of a Xenopus Melanophore
microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) /;(四)暗视野显微镜;(五)相差显微镜;原理;用途:观察未经染色的玻片标本。;(六)倒置显微镜;二、电子显微镜;1. 原理;表二、不同光线的波长;TEM LIGHT PATHWAY;TRANSMISSION ELECTRON
MICROSCOPE,TEM;2. 制样技术;2)负染技术;3)冰冻蚀刻;(二)扫描电子显微镜;Scanning electron microscope( SEM);工作原理:是用一束极细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子的多少与样品表面结构有关,次级电子由探测器收集,信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步的扫描图像。
为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属膜,重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。;SEM LIGHT PATHWAY;人类红细胞;酵母;(三)扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope,STM;三、显微操作技术micromanipulation technique;显微操作仪;;第二节 细胞和亚细胞组分的测定;(一)固定
物理固定:血膜空气干燥、冷冻干燥。
化学固定:如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定,显示酶类???用甲醛丙酮缓冲液固定。;(二)显示方法;二、免疫细胞化学法 immunocytochemistry;三、放射自显影术;四、细胞分离技术;(一)差速离心 Differential centrifugation;低速;(二)密度梯度离心;1. 速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;二、流式细胞术;三、细胞电泳;第三节 细胞培养与细胞融合;原代培养 (primary culture):即:培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养(passage),每代细胞分裂约3-6次。
细胞系(cell line):原代培养细胞成功传代即为细胞系。
细胞株(cell strain):从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。
克隆(clone):亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。;表三、实验室中常用的几种细胞系;Plant Cell Culture;二、细胞融合
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