分子生物学技术在环境微生物.doc

分子生物学在环境微生物 研究中的应用 姓 名：魏 孔 军 班 级：09 生 工 学 号：2009111015 分子生物学在环境微生物 研究中的应用 摘要:介绍了在环境微生物研究中的分子生物学技术,如核酸探针技术、聚合酶链式反应技术、电泳分离技术、基因重组及基因芯片技术等以及这些相关技术在环境微生物分类、环境微生物监测和环境微生物治理污染中的应用。结果表明,分子生物学技术在研究环境微生物中发挥了重要作用。 关键词:环境微生物；分子生物学技术；应用。 1、引言 分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学。近年来,随着分子生物学的迅速发展,其相关的研究技术已日臻完善。已经渗透到生命科学及环境科学的多个已经领域。自80年代以来,随着人类生活的进步和工农业生产的迅速发展。新的环境问题,如全球气候变暖、生物多样性锐减、生态系统退化。人类赖以生物圈受到广泛污染。大量人工合成的并难以被天然微生物迅速降解转化的污染物进入自然环境中,严重威胁人类及其它生物正常的生存和发展。其中,普遍存在与土壤环境中的重要有机污染物如多环芳烃、含N杂环化合物等。因其具有较高的致癌性、致畸性、致突变性而被认为是只要的污染物质。因此,快速、高效地监测、治理环境污染,已成为世界各国普遍关注的热点问题。分子生物学技术为环境污染的治理及环境微生物的监测及环境微生物的多相分类提供了快捷、准确、有效的方法。 2、与环境微生物研究相关的分子生物学技术 2.1、核酸探针检测技术 核酸探针检测技术属于分子标记技术, 利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针分析 DNA序列及片段长度多态性,被标记(放射性或非放射性 )的探针根据碱基互补配对原则,以原位杂交、Southern印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法,可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法灵敏性, 使得核酸分子杂交广泛应用于对环境微生物的检测。定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目标。 2.1.1、荧光原位杂交( FI SH )技术 荧光原位杂交技术的原理是用荧光染料标记基因探针,再使标记的探针与前期固定在载玻片上的微生物样品杂交,洗去未杂交部分后借助荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜进行观察和摄影。该技术可同时对不同类群的微生物在细胞水平进行原位的定性、定量分析和空间位置标示。目前,可通过 FI S H技术,利用一整套特异的寡核苷酸探针可进行单个微生物细胞的快速分类检测。 2.1.2、限制性片段长度多态性标记 限制性片段长度多态性是基于Southern印迹杂交的技术, 是在微生物多样性研究中广泛应用的DNA分子标记技术。是利用放射性同位素或某些非放射性标记探针与转移于支持膜上的基因组总DNA (经限制性内切酶消化 )杂交, 通过显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点变异的一种技术。应用特定的核酸内切限制酶切割有关的 DNA分子, 经过电泳、原位转膜印迹、探针杂交、放射性自显影后,分析与探针互补的 DNA片段在长度上的简单变化, RFLP多态性来源于①突变造成的决定限制片段数量的的限制性内切酶位点的存在与否。②两个限制酶位点间因 DNA插入、重排或缺失造成的长度差异。RFLP标记分辨率高, 共显性表达,在非等位基因之间不存在上位效应, 具有很好的重复性和准确性,被广泛应用于基因定位、指纹分析、确定亲缘关系、遗传多样性分析等方面, 是发现最早,具有代表性的DNA分子标记技术。它可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因型多样性的可靠方法,同时,可作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法[ 7]。 2.1.3、随机扩增多态性标记 RAPD是1990年美国杜帮公司的科学家J .G .K . Williams和加利福尼亚生物研究所J .welsh两个研究小组几乎同时发展起来的检测DNA多态性技术，其通过PCR扩增的产物在正常情况下可被视为基因组上的一个位点，就某一特定引物而言,它与基因组结合位点的序列互补,决定了扩增产物具有一定的特异性,如果不同个体在结合位点上的序列因突变存在差异, 或两个结合位点间由于 DNA序列的插入、缺失造成距离变化,就会形成扩增产物的出现或长度变异等多态现象。RAPD技术可在各种生物没有任何分子生物学研究的情况下进行DNA多态性分析, 构建基因指纹图谱等研究。PAPD技术所需模板 DNA的量极少, 只要其中有特定的 DNA片段,就可扩增该片段。由于引物设计是随机的人工定序合成,一套引物可用于多个物种的基因组 DNA多样性分析,基于以上特点, RAPD自发明以来被广泛应用于各类的生物研究。同时, 在环境微生物的分类研究中也得到广泛应用。 2