基因工程的基本操作程序课件-高二下学期生物人教版选择性必修3(1).pptx

第2节基因工程的基本操作程序2

二、利用PCR获取和扩增目的基因复制次数123nDNA分子数248含引物的DNA分子数248含引物1（或2）的DNA分子数137同时含引物1和2的DNA分子数026消耗引物数量26142n2n2n-12n-22n+1-2

5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’目的基因目的基因利用PCR技术扩增目的基因，在第三次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）。思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？

二、利用PCR获取和扩增目的基因复制次数123nDNA分子数248含引物的DNA分子数248含引物1（或2）的DNA分子数137同时含引物1和2的DNA分子数026消耗引物数量2614两条链等长的DNA分子数002DNA分子种类2452n2n2n-12n-22n+1-22n-2n5

二、利用PCR获取和扩增目的基因思考1：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。原因：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。思考2：用PCR可以扩增mRNA吗？不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。单链RNA逆转录酶杂交双链DNA链RNA链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNAPCR扩增

二、利用PCR获取和扩增目的基因100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp1,200bp1,000bp900bp标准样品1样品2样品3较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。4.PCR扩增产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。

基因表达载体的构建思考·讨论获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞？即使可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解。不能那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？

基因表达载体的构建1.构建的目的（1）让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。（2）同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）基因表达载体抗虫基因与载体拼接

基因表达载体的构建2.载体组成（1）启动子：①本质：一段有特殊序列结构的片段。DNA②位置：位于基因的，紧挨。上游转录的起始位点③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。表达载体启动子目的基因终止子复制原点标记基因

基因表达载体的构建诱导型启动子诱导物作用目的基因表达激活或抑制④诱导型启动子：有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。

基因表达载体的构建（2）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的片段。DNA②位置：位于基因的。下游③功能：使转录在所需要的地方停下来。（3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。启动子终止子标记基因复制原点目的基因

基因表达载体的构建（4）目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。（5）复制原点：DNA复制的起始位点。注意：目的基因必须插入到与之间。启动子终止子

基因表达载体的构建（1）首先用一定的切割载体（质粒），使它出现一个切口。限制酶3.构建过程

基因表达载体的构建（2）然后用限制酶或能产生末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。同种相同

基因表达载体的构建（3）再利用将含目的基因的DNA片段拼接到的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。DNA连接酶载体

基因表达载体的构建问题：使用同种限制酶进行切