第四章蛋白质的化学修饰选读.ppt

* 第 4 章 蛋白质的 化学修饰 化学修饰的原理 化学修饰的方法学 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 亲和标记 蛋白质化学修饰的应用 内 容 提 要 化学修饰：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质 共价结构发生改变的现象。 选择性化学修饰：肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。 第一节 化学修饰的原理 影响因素 蛋白质功能 基的反应性 修饰剂的 反应性 一、影响蛋白质功能基反应性的各因素 因为大多数蛋白质分子是（亲水的表面，疏水的核），所以pk值和影响pk值的因素应特别关注。 （一）微区的极性 微区的极性是决定基团解 离状态的关键因素之一。 醋酸的 pk值 在水中为4.76 在80%乙醇中为6.87 在100%乙醇中为10.32 微区的极性与介质的介电常数有关。 （二）氢键效应 天然蛋白质或它的离子通过氢键来维持其稳定性，也是使pk值发生改变的一个因素． （三）静电效应 研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的pk值是不同的，原因是由于带电基团相互影响所致。 局部极性 的变化 对色、甲硫、胱氨酸反应性影响最小 对酪、半胱氨酸、羧基反应性影响最大 对氨基和组氨酸反应性影响较大 例如：2-氟酚的pk值比2-溴酚的pk值高0.7pH单位，原因是氟与酚形成氢键的能力比溴强。 水杨酸 碳酸酐酶： 5.91； 6.04； 7.00； 7.23 葡萄球菌核酸酶： 5.37； 5.71； 5.74； 6.50 （四）位阻效应 如果烷基在空间上紧靠功能基，修饰剂不易与功能基反应，出现位阻效应。 影响蛋白质中可电离氨基酸侧链的pk值的因素，也是影响侧链基团反应性的重要因素。蛋白质中个别功能基所处的微区不同，反应性也不同，个别功能基的反应性可通过竞争标记法来测定。 二、蛋白质功能基的超反应性 例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，其pk值是： 影响功能基pk值 基团之间的功能障碍 影响功能基反 应性的因素 多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性要差。但是，每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。 影响超反应性的因素： 1.改变蛋白质功能基的pk值； 2.蛋白质功能基具有较大的亲核性； 3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； 4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性； 5.试剂的结合。 超反应性可由上述一个或几个因素的综合作用而产生。 超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常 迅速的反应。 三、修饰剂反应性的决定因素 蛋白质的构象和表面特性对氨基酸侧链的反应性有影响，同样，它们也可能对接近功能基的修饰剂产生有利或不利的影响。 木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基， 只有一个能与修饰剂反应，修饰 后酶活性并不改变，说明什麽？ （一）选择吸附 化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附在低或高极性区，根据对速度的饱和效应，可检测出蛋白质-修饰剂复合物的形成。 （二）静电相互作用 带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。 静电排斥力能抑制修饰作用。 （三）位阻因素 蛋白质表面的位阻因素，或者底物、辅助因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。 D-氨基酸氧化酶的巯基与N-烷基马来酰亚胺的反应，巯基的辛基化速度比乙基化速度快15倍。 核糖核酸酶第12 号组氨酸烷化 α-溴代丁酸反应很快； α-溴代戊酸反应很慢； α-溴代己酸不能反应。 （四）催化因素 修饰部位附近的其它功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂，反应速度和反应部位有明显差异。 （五）局部环境的极性 溶剂效应是复杂的。有些有机反应的速度与溶剂的极性有关，有些反应则与极性无关。 反 应 类 型 降低极性对速度的影响 ⑴RSR+ICH2CONH2→[R2S+CH2CONH2]I- 溶剂极性对反应速度的影响 适当降低或大大降低 没有影响 没有影响 适当增加或大大增加 ⑵RSR+H2O2→R2SO+H2O ⑶RS-+ICH2CONH2→RSCH2CONH2+I- ⑷RNH3++OCN- →RNHCONH2 胰凝乳蛋白酶活性中 心丝氨酸的乙酰化 硝基苯乙酸盐反应强 苯乙酸盐反应弱 疏水环境 阻止产物中电荷分离的反应 加速电荷中和的反应 第二节 化学修饰的方法学 一、修饰反应专一性的控制 （一）试剂的选择 选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。 反应类型⑴ 反应类型⑷ 对于没有电荷分离和电荷只是从一个离子转移到另一个离子的反应，则介质的极性不重要。 对氨基 的修饰 修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。 修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。 选择蛋白质修 饰剂要考虑： 修饰