木瓜蛋白酶提取实验记录.doc

木瓜蛋白酶实验记录 ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。 ⑥分装木瓜蛋白酶原液。00r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水 取3ml酶液（编号酶液2），-20℃保存 7+1 置冰桶中 2.7 静置30min, 离心4000r/min, 30min，弃沉淀 8 静置30min, 离心4000r/min, 30min，取沉淀 10 编号酶液3，-20℃保存 酶原液2 编号酶液5，-20℃保存 2016．11.4 试剂配制 考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。 重提木瓜蛋白酶 实验设置对照 一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。 ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（编号为酶液1）。 ⑥分装木瓜蛋白酶原液。00r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水 取1ml酶液（酶液B5.5），-20℃保存 9+1 置冰桶中 2.5 静置30min, 离心4000r/min, 30min，弃沉淀 上清（编号酶液B6.6） 2.7825 静置30min, 离心4000r/min, 30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水 取1ml酶液 上清（编号酶液B7.7）沉淀（编号酶液B8.8），-20℃保存 酶原液4 编号酶液B9.9，-20℃保存 2016.11． 5 试剂配制 标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。现配现用。 酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.2g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液160mL（取2.866g磷酸氢二钠固体加160mL蒸馏水即得溶液），置沸水浴中煮30min，时时搅拌，冷却至室温。加1M盐酸调节PH至7.00.1 。加蒸馏水稀释到200mL。用前配置。 酶稀释液：A液 称取半胱氨酸2.635g，氯化钠11.7g，加蒸馏水250mL溶解 ；B液 称取乙二胺四乙酸二钠1.115g，加蒸馏水100mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀释至500mL 。用前配置。 三氯乙酸溶液：取三氯乙酸3.6g，加乙酸钠5.98g和冰乙酸3.8mL，加水溶解并稀释至200mL。 酶活性的测量 酪氨酸标准液和酶液处理 酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。（此为50ug/ml的标准液） 酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。 操作 (待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。 (空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。 (酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处测定吸光度An。 分别测量酶液的酶活力 管号 A A0 酶液1 1.161 1.175 0.291