基因工程之微生物知识竞赛.ppt

* 基因工程之 微生物知识竞赛 为了治理石油泄漏，美国科学部门利用基因工程技术生产了一种能分解大部分烃类的微生物，他们是怎么做到的？ 答:将能分解己烷，辛烷和癸烷，降解二甲苯和甲苯，降解萘和分解樟脑的四种假单胞杆菌的不同质粒转入同一假单胞菌种，获得超级细菌。该细菌能在几小时内降解掉海上溢油中三分之二的烃类。 为什么漫画中的两个细菌不怕抗生素？他们形成的原理是什么？ 因为他们具有抗生素抗性。使用大量抗生素进行筛选和基因工程对细菌进行突变是这种细菌产生的原因，而基因突变是产生此类细菌的根本原因。但在自然状况下，变异菌在不同微生物的生存斗争中未必处于优势地位，较易被淘汰。抗生素的滥用则是这类细菌今日如此盛行的导火线，由于人类滥用抗生素，使得原平衡中的优势种被淘汰，而这种“抗抗生素”的细菌则顺利成长的成为了优势种，取得了生存斗争的优势地位，从而得以大量繁衍、传播。 世界上存在各式各样的微生物，在基因工程中常应用的微生物有哪些？ 答：大肠杆菌，根瘤农杆菌，噬菌体，酵母菌等。 答： (1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记； (4)引入终止突变。 如何将野生型的噬菌体改造成为一个理想的载体? 答：为了扩增突变体的 thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与 thyA基因 的5’端相同，另一个引物同该基因的 3’端互补。在引物的 5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体 DNA同引物混合后，进行 PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。 假定你分离到一个 E．coli 的 Thy-突变体，并推测有可能是 ThyA 基因突变。请设计一个方案用 PCR 从染色体DNA扩增突变的 ThyA 基因，测定突变的序列。(注：E．coli 野生型的 ThyA 基因的序列是已知的) 小丁用蓝白斑做阳性克隆筛选,因为疏忽没有在选择性培养基中添加X-gal,结果长出的菌斑全为白色试问：（1）这些白斑是否全为阳性克隆,形成白斑的原理是什么？（2）如果不是,通过哪些方法可以从这些白斑中选择真正阳性克隆？ 答：（1）不是.因为没有生色底物x-gal,阴性菌落虽然可以表达lacZ,但无法显色. （2）A)全部影印至含X-gal的新鲜选择培养基上,培养后看是否为白色. B)以pcr法对所有菌落作鉴定. C)所有菌落转接至液体培养基扩增后抽质粒,看质粒大小. 小李家的土地由于长期种植小麦，没进行轮作，土地严重缺氮，如何利用基因工程手段在尽量短的时间里让小李家的土地恢复正常生产？ 答： 利用基因工程手段对根瘤菌进行遗传改造，如引入多拷贝的固氮酶的正调控基因nifA基因，或在该基因上游加入增强子和强启动子。大幅提高根瘤菌的固氮作用。（美国已有在基因组中整合了外源dctABD基因的转基因苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti)能大幅提高固氮能力和大田苜蓿产量，并已通过遗传工程安全性评价进入商品化生产。）（我国也有重组大豆根瘤菌HN2已通过农业部农业转基因安全评价审批进行环境释放。 小李家开的发酵工厂生产菌株经常因噬菌体“感染”而不能正常生产，小李很苦恼，头发都快愁白了。在排除了外部感染的可能性后有人认为是由于溶源性菌裂解所致，小李想问你的看法如何？可以帮他设计个实验证明一下吗? 答：溶源菌是指在核染色体组上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌（或其他微生物），具有自发裂解、诱导、免疫性、复愈、溶源转变等特性。? 检验方法是将适量发酵液与大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生活周期者）相混合，然后加至琼脂培养基中倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，所以会产生一个个中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。 农杆菌LBA4404的转化 — 冻融法1)将1μl构建好的植物表达载体质粒加入到100 μl农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；2)于液氮中速冻2-3min，37℃温浴3min；3)加入500μl 无抗生素的YEP液体培养基，28℃轻摇2－4h，消除感受态；4)从该培养物中取50－200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的YEP选择平板（Rif R , Str R ,Km R）上，28℃倒置培养两天。上述为小胖同学做农杆菌转化步骤，为什么在第二步中他要放入液氮中速冻2-3min呢？ 答：与大肠杆菌转化时热激原理相同，为转化反应提供一个低温环境，使转化效率更