弗氏柠檬酸菌的酶法合成解析.ppt

姓名：张秀婷 班级：生物制药1211 弗氏柠檬酸菌 柠檬酸菌属直杆菌、直径约1.0，长2.0~6.0μm，单个和成对。 柠檬酸杆菌属是肠道菌中常见的非致病菌，由于该菌与肠道中的致病菌沙门氏菌十分相似，故在肠道细菌的分类鉴定中非常重要。 英文名：L-Tyrosine 学名：2-氨基-3-对羟苯基丙酸。一种含有酚羟基的芳香族极性α氨基酸。是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸。符号：Y CAS　No.：60-18-4 产品描述：白色结晶体或结晶粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸或稀硝酸中溶解。 生产标准：AJI92，USP26，EP4 分子式：C9H11NO3 相对分子量或原子量：181.20 密度：1.456 比旋度：-11.3°至-12.1° 【性状】 l-体从水中结晶出来者，无色至白色丝光针状结晶或结晶性粉末；d-体从水中结晶者为无色晶体；dl-体从水中结晶者为有光泽的针状晶体。为动物体内非必需氨基酸！ 【制备或来源】 ⑴由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取； ⑵以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得； ⑶以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用β-酪氨酸酶催化制取 L-丝氨酸的结构式 【用途】 与糖类共热可产生氨基羰基间的反应，而产生一种特殊的香料。必需氨基酸。 酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。 L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。 酪氨酸酚裂解酶( tyrosine phenol-lyase，TPL，EC4) ，也称 β-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。 TPL催化L-酪氨酸裂解的最适pH为8.2，pH6.0时该酶基本没有活性。一般认为这种高、低pH情况下的酶活差异是由于pKa约为7.8的二种催化碱的质子化引起的。 1、丙酮酸路线 L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。 Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C.intermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和55mmol/L苯酚的转化体系，反应5h后可积累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%，且稳定性可维持5d。 2、L-丝氨酸路线 由于L-丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶(EC2．1．2．1)催化甘氨酸和甲醛廉价制备，Lee等用产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)和E．Herbicola ATCC 21434分别作为丝氨酸羟甲基转移酶和TPL的酶源，将以甘氨酸为底物合成L-丝氨酸的反应和以L-丝氨酸为底物合成L-酪氨酸的反应相偶联，反应体系含甘氨酸0．25mol/L、PLP0．5mmol/L、四氢叶酸0．7mmol/L、初始苯酚浓度0．32%，以37%甲醛启动反应16h后，可产生L-酪氨酸26．3g/L，甘氨酸转化率为61．4%，但该工艺存在甘氨酸对TPL抑制较强和操作复杂的明显不足。 3、S-邻硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)是TPL适宜的人工底物，其Vmax比生理底物L-酪氨酸高三倍，而Km仅为L-酪氨酸的50%。Phillips等以C．Freundii ATCC 29063细胞悬液作为酶源，4mmol/LSOPC和4mmol/L苯酚反应2h，苯酚的转化率就达到70%，而且这一反应的最适pH较为宽泛(6．8～9．0)。不过，SOPC价格较高，从而限制了该工艺的工业化应用。 酪氨酸—酪氨酸的测定—电位滴定法 本方法适用于酪氨酸的含量测定。 方法原理：供试品加无水甲酸溶解后，再加冰醋酸适量，照电位滴定法（附录Ⅶ A），用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于18.12mg的C9H11NO3。 电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，和直接电位法相比，电位滴定法不需要准确的测量电极电位值，因此，温度