第三章基因操作的基本技术介绍.ppt

DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 DNA变性方法 热变性：90－100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛 DNA复性或杂交(hybridization) 形成DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA杂交分子。 影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度（浓度大，复性快；分子量大，复性慢） 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点。 Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜、毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 探针的标记 探针的种类： cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 核酸标记物： 同位素标记： 125I，3H，14C用于蛋白质标记；32P，3H，35S用于核酸标记； 非同位素标记：生物素；半抗原（包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕）；荧光素等。 蛋白质检测标记物：酶偶联二抗、 蛋白质A、IgG、 免疫金等。 探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针的纯化 核酸杂交的应用： 医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。 1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定 3、癌基因点突变分析 4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定 其它应用： 1、侦察犯罪或尸体辨认 2、鉴定亲缘关系 桑格(Frederick Sanger)，是英国生物化学家，1918年8月13日生于英格兰格洛斯特夏郡，在剑桥大学圣· 约翰学院获哲学博士学位，毕业后到著名的剑桥医学研究会分子生物学实验室工作。桑格的工作主要研究蛋白质的结构，特别是研究测定胰鸟素分子的结构，成功地测定了胰鸟素的精细结构，因而获得了1958年的诺贝尔化学奖。60年代后他致力于核糖核酸（RNA）和（脱氧核糖核酸）DNA的结构研究，利用酶解图谱法确定了RNA中各种碱基的排列顺序和DNA中核甙酸的排列顺序，所以1980年再度获诺贝尔化学奖。 测序主要过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分为4个反应系统，分别加入DNA聚合酶、dNTP、标记底物； 终止剂不同：ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳：按ACGT次序加样进行高压电泳 4.放射自显影得到直读图象 Sanger末端终止法具体原理： 双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。 所需物质： 待测单链DNA、模板、引物、四种dNTP(其中一种用32P/35S标记)、终止剂(ddNTP)、DNA聚合酶； 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段 测序的样品要求： 测序由于是要进行特殊的PCR反应的，因此对样品的要求与其他试验的要求有所不同分别简述之： 1. 样品的纯度：PCR具有短时间内高效的扩增能力，因此样品的纯度对反应有至关重要的影响。当样品不纯的时候，那些杂质会对实验结果产生干扰。这在PCR产物测序中表现的尤为明显，在测序结果上表现为峰图杂乱，过多的不可识别的碱基。 2. 样品的量：当最低限度的模板量也不能提供的话，会引起测序反应的异常，表现为无反应，峰图弱，或者反应中断等。 3. 样品的形式：这里专指纯化的PCR产物和质粒样品。正常情况下，溶解样品时常用的溶液有以下几种形式：水，Tris 溶液，TE（Tris—EDTA）三种。当采用TE为溶剂的时候由于溶液中的EDTA可以干扰测序反应的进行，因此实验人员在进行测序时需要注意样品的溶解方式。 3. 两种定序方法的比较 1) 化学法 i. 优点: 所有片段具有相同的标记强度； 一次可以读出250-400个核苷酸；定序分析 不需要次克隆；不受二级结构区的影