南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室.doc

生物化学实验报告 姓 名： 学 号 专业年级 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 实验日期 实验地点 第实验室 指导老师 评分 教师签名 批改日期 实验目的 实验原理 材料与方法 步骤 操作 现象 （1）盐析 取离心管一个，加入0.8mol人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用 溶液由淡黄色透明状转变为白色浊液，离心后溶液分层，上层澄清，下层为白色沉淀 （2）溶解沉淀 向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化γ球蛋白用 白色沉淀完全溶解，液面有泡沫产生 步骤 操作 现象 （1）调节层析柱液面 葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH6.5?NH4AC缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面? 液体缓慢低落，约每三秒钟两滴 （2）加样品 用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止 3）洗层析柱 ?小心用0.02mol/L、pH6.5?NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液? （4）洗脱 待样品液进入凝胶床内，继续用0.02mol/L、pH6.5?NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液量 （5）检测及收集蛋白质 ?在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，①滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为5.5ml时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。②收集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集?收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱，进行离子交换层析? 磺基水杨酸在接受层析柱低落液前两次显现澄清，第三次产生白色沉淀，黑色板孔氯化钡部分第一次即出现白色沉淀 (6)层析柱再生平 衡 收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L?pH6.5?NH4AC缓冲液流洗，用BaCl2液检测层析柱流出液，当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后，继续洗涤2~3ml。凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用 氯化钡部分在连续接受几次滴入后沉淀颜色变淡，直至完全无沉淀 ③?球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱 步骤? 操作 现象 （1）调节层析柱换冲液面 经处理再生好的DEAE纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体的流出量。 2）加样品 ?将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止。? （3）洗层析柱 ?小心用1ml?0.02mol/L?PH?6.5的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液。? （4）洗脱 ?待样品进入纤维素柱床内，继续用0.02mol/L?PH?6.5的醋酸铵缓冲液流洗，同时注意流出液量? （5）检测及收集蛋白质 ?流洗时，随时用0.92mol/L磺基水杨酸检查流出液中是否含蛋白质（方法同前）当有蛋白质出现时，立即连续收集三管，每管10滴，此不被DEAE纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用。 现象同前 注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。? 步骤 操作 准备 电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液，使其在同一水平a，页面与支架距离2~2.5cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥? 薄膜准备 将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄膜一段1.5cm处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔做记号。进入巴比妥溶液中直至浸润完全。用镊子青青取出，粗面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓