第二章基因操作的主要技术原理-1.ppt

四 Western杂交 是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白。 蛋白质混合样本经过SDS电泳后，分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗血清或单克隆抗体相应的待检测蛋白质（抗原蛋白）。 Step 1. Antibody Recognition of target protein/antigen Step 2. Secondary Antibody recognition of primary Ab Step 3. Color Development Western杂交的操作步骤 Western Blot 检测HIV 电转印：将PAGE胶上的蛋白质条带转移到NC膜上（粗糙面贴在胶上）。 — + 将NC膜与抗血清一起孵育，使抗血清（一抗）与特异蛋白条带结合， 再与经过荧光素、酶或同位素标记的二抗反应， 可检测出样品中待检抗原及其含量。 ◆ Southern印迹法(DNA印迹法,Southern blotting)：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。因这一技术是英国科学家E.M.Southern首先创建的，而且这一转移过程与墨迹被吸印到吸墨纸上的过程相似，所以用他的姓氏命名为Southern印迹法。 ◆ Northern印迹法(RNA印迹法,Northern blotting)：Alwine等人将Southern印迹法应用于RNA，原理与Southern印迹法相似。Alwine等人根据命名Southern印迹法的姓氏中含有“南部” 之意，风趣地把他们的RNA印迹法称为“北部”印迹法（Northern blotting）。 ◆ Western印迹法（蛋白质印迹法，Western blotting）：是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。人们把这种以电驱动为转移方式的蛋白质印迹法诙谐地称为“西部”印迹法（Western blotting）。 ◆ Eastern印迹法（Eastern blotting）：也是一种蛋白质印迹法，与Western印迹法不同之处是：先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。这一方法又被称为Eastern blotting。 目前常用的四种印迹法概览： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 Eastern blot 双相蛋白质印迹法，用于检测蛋白质组。 OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统 优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。 聚丙烯酰胺凝胶浓度（%） 分离DNA片断大小（bp） 4.0 10.0 20.0 1000—100 500—25 50—1 三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳：1000——50000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：1——1000bp 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10％ ）。 PolyAcrylamide Gels 聚丙烯酰胺凝胶电泳 步骤 1、组装凝胶灌制装置 3、注入聚丙烯酰胺凝胶 2、配胶 点样处 加电压 - + 去除鲨鱼齿梳 用1xTBE洗涤胶顶 H21 Mo17 147bp 123bp 238bp 242bp 309bp 404bp 527bp 622bp 160bp 180bp 190bp 201bp 217bp 1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的DNA分子 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 分离分子量高达107bp的DNA大分子 四 、脉冲电场凝胶电泳（PFGE） PFGE can resolve large DNA fragments (molecule hybridization) 分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交 ，及由此简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。