猪源乳酸菌的分离鉴定及比较基因组学分析.pdf

摘要

随着我国“禁抗令”的推行，植物提取物、益生菌、酶制剂等众多替抗产品正在

迅猛发展，乳酸菌作为益生菌的重要组成部分，其在畜牧养殖方面的研究和应用大幅

增加，但关于乳酸菌的负面报道也与日俱增。越来越多的研究证明，在不同种属乳酸

菌中均可检测到耐药或毒力基因的存在，乳酸菌是否会介导这些耐药或毒力基因的传

播，这一问题日益受到国内外研究者的高度关注。本研究从安徽省规模化养猪场收集

的粪便样本中分离乳酸菌，对其耐药表型及携带的毒力、耐药基因情况进行统计，筛

选出乳酸菌代表菌株，进一步对代表菌株进行生物学表型检测，最终筛选出三株不同

种属的乳酸菌（屎肠球菌BY、戊糖片球菌SL、植物乳杆菌GZ），采用Illumina+PacBio

平台完成细菌全基因组测序，旨在进一步对其进行安全性评价。为深入了解屎肠球菌

（E.faecium）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）、植物乳杆菌（L.plantarum）三种乳

酸菌的益生及安全性，本研究分别筛选并收集了对应菌株2021—2024年上传至NCBI

的全基因组序列，构建三种乳酸菌的泛基因集，并分别对其进行注释和分析。主要研

究内容及结果如下：

1、猪源乳酸菌的分离及测序菌株的筛选

本研究猪粪便样本中共分离出97株乳酸菌，这些乳酸菌主要分布于植物乳杆菌

（L.plantarum），粪肠球菌（E.faecalis），屎肠球菌（E.faecium），戊糖片球菌（P.

pentosaceus），乳酸片球菌（P.acidilactici）5个种内，通过耐药表型检测发现，这些

乳酸菌对氨基糖苷类药物耐受性相对较高，且肠球菌的耐药性显著高于其他种属乳酸

菌，毒力和耐药基因的检出也主要集中在粪肠球菌和屎肠球菌。为进一步筛选5个属

的8株代表菌株（乳酸片球菌R101、R117，戊糖片球菌R124，屎肠球菌F106、F130，

粪肠球菌F109，植物乳杆菌Z108、Z119），本研究以IPEC-J2为模型检测代表菌株

细胞黏附能力，同时进行一系列体外实验研究代表菌株不同生物学特性，实验结果表

明：Z108表面疏水性最高，最低的为F106；F109自凝聚能力和黏附性最低，R124自

凝聚能力和黏附性最高。以S.aureusATCC25923和E.coliATCC25922为模型检测

代表菌株病原菌凝集能力，与S.aureusATCC25923凝集率最高的是R124、与E.coli

ATCC25922凝聚率最高的是F109。此外，对代表菌株进行一系列生物学特性检测，

其结果表明，F106、F130、F109相较于其他5株更快的进入对数生长期，同时pH值

下降速度也相应较快；在耐受性实验中，R101在pH2.0条件下存活率最高，F130在

5g·L-1猪胆盐处理后存活率最高，F130在60℃热处理5min后存活率最高。

综合比较各代表菌株体外实验结果，最终筛选出三株乳酸菌(屎肠球菌F130更名

II

为BY；戊糖片球菌R124更名为SL；植物乳杆菌Z108更名为GZ)进行测序。

2、屎肠球菌BY、戊糖片球菌SL、植物乳杆菌GZ全基因组学分析

BY基因组共包含1条染色体基因和7个质粒基因组，平均GC含量为38.25%，

注释到3,015个蛋白质编码基因（CDS），占基因组的84.92%。BY基因组中预测到

58个重复序列，占基因组的0.35%。在进行碳水化合物预测时，BY基因组共有94个

CDS被注释到GH、CE、AA、PL、GT。而对其进行可移动元件预测分析发现，其包

含25个基因岛、4个前噬菌体、5个可能的CRISPR位点、37个可能的插入序列以

及51个转座子序列，值得注意的是，BY基因组中预测到4个毒力基因以及23个耐

药基因，耐药基因中9个位于PlasmidA上，1个位于PlasmidE上，而在BY的7个

质粒中，PlasmidE被注释为金黄色葡萄球菌的质粒，PlasmidF被注释为乳酸乳球菌的

质粒。基于此，本研究对PlasmidE的可转移性进行了验证，实验证明在抗生素存在

的条件下，PlasmidE可转移至受体菌中，造成耐药性的传播。

SL基因组中只包含1