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乳酸菌的分离、纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定

第一部分：乳酸菌的分离、纯化

一、实验器材:

1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸钙；

0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯)、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g

香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g；

2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤：

1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：

（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）

（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO310g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa121℃高压蒸汽灭菌20Min。

以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。

用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.1ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。

6.脱脂乳试管的配制与灭菌

直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。

7.菌落观察

恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

8.乳酸菌的分离纯化

选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。

9.乳酸发酵及检查

发酵：观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征，选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，40～42℃静止培养。

取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片；结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染，干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对或短链或长链状。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。

第二部分：乳酸菌鉴定

一、实验器材

1.蛋白胨水培养基：蛋白胨10g,氯化钠5g,水1000ml,PH:7.2~7.4

121摄氏度湿热灭菌20min

2.糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000ml,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2ml,PH:7.6,另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10ml.

有关试剂

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。

吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g,95%乙醇760ml,浓盐酸160ml.

10%硫酸，2%高锰酸钾

含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银2g,蒸馏水100ml,待硝酸银溶解后，取出10ml备用，向其余的90ml硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。

二、鉴定试验

1.形态和培养特征观察

采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。

染色方法：涂片固定；草酸铵结晶紫染1分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染约1分钟；水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，