荧光定量pcr技术与常见问题分析.ppt

日常实验中的注意事项 实验室分区 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 使用带滤芯的吸头 光学平盖八联管（或96孔板+光学盖膜），不可裸手触摸盖或膜。 尽量不要在八联管和96孔板上做标记 阳性对照和阴性对照 反应后PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启。 It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. An example of the cycle-cycle range of baseline. An example of the cycle-cycle range of baseline. An example of the cycle-cycle range of baseline. An example of the cycle-cycle range of baseline. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. 绝对定量实验 选择目标→提取/PCR →纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释 Ct值在17-30之间，覆盖全部样品浓度区间 10倍连续梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v 标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 注：不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v 标准品梯度稀释方法 绝对定量实验 扩增效率：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比。 PCR效率的测定 常见问题分析 1.扩增效率为什么达不到100% 主要原因： 样品不纯 扩增产物太长 没有选择合适的引物退火温度 引物的设计有错配 模板的序列特殊（比如GC含量高） 抑制物的存在 2.扩增效率为什么会大于100% 主要原因： 背景污染 非特异性扩增 3.实验结果的重复性不好 对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为3个重复） 目标是所有复孔CT值都相近(通常SD值小于0.167) 3.实验结果的重复性不好 重复性好 3.实验结果的重复性不好 重复性差 3.实验结果的重复性不好 主要原因 加样误差（操作?加样器?） 没有将试剂和样品充分混匀 低拷贝的样品??泊松分布 没有使用ROX校准(或者其他校准孔间误差的方法) 3.实验结果的重复性不好 ROX校准 Master Mix中ROX浓度固定 ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关 ROX的功能：校准物理误差 耗材质量：管盖厚度、透光性能 仪器稳定性：孔间批间波动 反应体系监控：蒸发 卤素灯光源 光学系统 盖膜或管盖 管壁光滑性 反应体积 3.实验结果的重复性不好 ROX校准大大改善各拷贝复样的重复性 (参比荧光) (报告荧光) 10 ng Sample A Well 1 Well 2 Rn = Normalization = 报告荧光 / 参比荧光 (这个normalization是自动的) 4.其他问题 标准曲线线性不好 引物特异性不好 阴性对照有扩增 退火温度的选择 两步法还是三步法 …… 扩增产物50-200bp，不要超过300bp Ct值17-30之间 扩增效率在90-110%之间 引物的特异性要好，熔解曲线单峰。 内参基因的选择 选择跟目的基因表达量接近的 多个内参（当一个内参基因的表达量不够恒定时） 在不同样本中内参的Ct值不能相差过大 日常实验中的注意事项 QUESTIONS? THANK YOU! SDS is a product line with 2 main missions. It’s very important that