123硫酸鱼精蛋白生物测定法-中国药品检验标准操作规范2010年版.doc

硫酸鱼精蛋白生物测定法 一、兔全血法 1 实验材料及用具 1.1 天平 精度 0.01mg或0.1mg 肝素标准品或供试品称量用 精度 1mg 试剂称量用 精度 10g 家兔称重用 1.2 恒温水浴37℃±0.5℃。 1.3 压板测凝器或测凝棒。 1.4 实验用具 兔固定板、注射器及取血用针头、吸管、移液管、烧杯、带塞玻璃小瓶、小试管（0.8cm×3.8cm或1.0cm×7.5cm，有1ml刻度）、试管架、不锈钢或细玻璃搅棒、记时器、安瓿、脱脂棉、纱布、线、绳。 1.5 手术用器械 剪毛剪、手术刀、直镊、止血镊、眼科直镊、眼科弯镊、动脉夹。 1.6 试剂 局部麻醉剂（如普鲁卡因）、氯化钠。 2 溶液配制 2.1 生理盐水 称取氯化钠适量，加水配成0.9%溶液。 2.2 1%普鲁卡因溶液 称取普鲁卡因粉末适量，用生理盐水配成1%溶液。 2.3 肝素标准品溶液 2.3.1 取肝素标准品，放置至室温。 2.3.2 割开标准品小管（注意勿使玻屑掉入），精密称量，置小烧杯中。 2.3.3 将称得的毫克数，乘以标示单位数，得总单位数。 2.3.4 精密加生理盐水，配成200U/ml溶液，密塞，置4~8℃保存备用，可在一周内使用。 2.4 肝素标准品稀释液 2.4.1 实验当日，取肝素标准品溶液，放置至室温。 2.4.2 精密量取标准品溶液一定量，用生理盐水配成85、90、95、100、105、110、115、120、125U/ml的标准品稀释液。 2.5 供试品溶液 2.5.1 粉末 实验当日，精密称取供试品适量，按干燥品计算，用生理盐水溶解配成 1mg/ml的溶液，充分混匀。 2.5.2 注射液 2.5.2.1 取供试品，放置至室温，割开安瓿。 2.5.2.2 精密量取安瓿内溶液一定量，按标示含量计算，加生理盐水稀释成1mg/ml的溶液。 3 实验动物 健康无伤，体重2.5kg以上的家兔，雌雄均可，雌者无孕。 4 检定法 4.1 实验当日，将实验动物仰卧固定在手术台上，剪去颈部的毛，或用生理盐水湿润的棉花或纱布，将毛向两侧分开，皮下注入1%普鲁卡因溶液20ml，10~20min后，用手术刀沿颈部正中线切开皮肤，用止血钳、镊小心分离开肌肉和血管，暴露并剥离一侧颈动脉一段约3cm长，两端分别用动脉夹夹住，或结扎远心端，用另一较粗的棉线在此段血管下穿过，打一活结，于棉线结扎处刺一小孔，做好取血前的准备。 4.2 取管径均匀小试管8支，置试管架上，第1和第8管为空白对照管，第2~7管为供试品管。分别在试管上编号。 4.3 空白对照管中加入0.2ml的生理盐水，第2~7管中分别加入供试品溶液0.1ml。 4.4 第2~7管中再分别加入上述肝素标准品稀释液0.1 ml，立即混匀。 4.5 用尖端磨钝的12号针头，插入兔颈动脉小孔内，用棉线打活结固定，每次取血时，放出少量血丢弃，然后接注射器，打开近心端动脉夹，血即流入注射器内，此时开始记时，至需要量后，迅速用动脉夹夹住，取下注射器，并立即接一较粗长的针头，按编号顺序，依次插入到各试管刻度上方，加血到刻度，迅速搅匀，注意勿产生气泡。 4.6 最后一管搅拌后，立即将试管架放入37℃±0.5℃恒温水浴中，血液抽出到试管架放入水浴时间不得超过2min，注意观察血液凝固情况。 4.7 终点观察 常用终点观察有两种方法： 4.7.1 倒转法 当小试管规格为1.0cm×7.5cm时采用此法。将小试管拿起，轻弹管壁，液面颤动利害时，可隔3min观察1次，当轻弹管壁，液面不太颤动时，隔1min观察1次，当液面接近凝固，轻弹管壁液面停止颤动时，将管轻轻倒立，液面不往下流为终点。 4.7.2 压板法或测凝棒法 当小试管规格为0.8cm×3.8cm时采用此法，以测凝棒不能再插入血液面为终点。 4.8 重复（4.2~4.7）操作，至少得5次结果。 5 结果判断 5.1 两支对照管的凝结时间相差不得超过1.35倍，如超过，则本次实验不能成立，要重新进行实验。 5.2 在供试品管的凝结时间不超过两支对照管平均凝结时间的1.5倍的各管中，以中和肝素浓度最高的一管作为终点管。 5.3 重复5次实验测得终点管的肝素浓度，相差不得大于10个单位，5次实验结果的平均值即为硫酸鱼精蛋白供试品1mg中和肝素的单位数。 6 计算举例 硫酸鱼精蛋白效价测定---兔全血法。 结果见下表。 硫酸鱼精蛋白效价测定结果（兔全血法） 实验次数 空白对照管(生理盐水) 肝素浓度(U/ml) 空白对照管(生理盐水) 空白管平均凝结时间的150% 1mg硫酸 鱼精蛋白 中和肝素U