药理实验方法学详细分析.ppt

目前尚缺乏依据中医病因病机理论建立的肝纤 维化动物模型。由于“证候”概念寓意深刻,包含的 信息量庞杂,是一个动态过程,具有复杂性、模糊性 和不确定性,因此证的研究受到很大的局限,与之相 关的肝纤维化的证候动物模型的研究也受到限制。 总之,理想的肝纤维化模型应具有人类肝纤维化的基本形态特征,其病理改变呈阶段性进展,模型制作具有可重复性以及低死亡率等到特点。今后应进一步加强肝纤维化动物模型研究,并结合中医理论寻找符合“证”本质的动物模型,从而促进中医药抗肝纤维化的研究。 体外模型 肝脏细胞分为肝实质细胞和非实质细胞，非实质细胞又可分为肝窦内皮细胞、 枯否氏细胞、Ito细 胞和隐窝细胞。它们在整个肝脏细胞中 (除外胆管细胞和血管细胞)所占的细胞百分数和体积百分比见下表。 大鼠肝脏细胞的种类和比例 细胞数（﹪） 体积（﹪） 肝细胞 60 92.2 血窦内皮细胞 19 3.3 枯否细胞 15 2.5 肝星状细胞 5 1.7 隐窝细胞 1 0.3 肝脏非实质细胞（间质细胞）在肝纤维化的发病过程中起到很重要的作用，其中以肝星状细胞的作用更为关键。建立这些细胞的体外培养，有助于研究肝纤维化的发病机制和影响因素，也可作为体外细胞模型观察药物对肝纤维化的影响。 因此，分离和培养这些细胞对于在细胞生物学和分子生物学水平上研究肝纤维化是及其重要的。下面介绍细胞分离和培养的方法。 肝星状细胞 枯否细胞 血窦内皮细胞 分离及培养 肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的分离与培养 （一）Nycodenz密度梯度离心分离法（文献报道较多） Sprague-Dawdey大鼠或Wistar大鼠，体重400g以上为宜。用戊巴妥钠腹腔麻醉(30mg/kg），用5 ％ 碘酒和75％酒精消毒皮毛。在洁净台中剪开腹部皮肤和肌肉，行门静脉插管输入D-Hanks液，pH7.3,同时剪断下腔静脉，并将肝脏游离取下，在体外灌洗肝脏直至洗清肝脏中的血液。当肝脏中的血液洗清后，从门静脉循环灌注还酶的D-Hanks液，37℃，pH7.4-7.5。 灌注液中含Ⅳ型胶原酶0.05 ％（W/V)、蛋白酶E0.1％ （W/V）、HEPES10mmol/L/、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、灌流速度为20-30ml/min,共消化肝脏约20-30min。停止灌注后用镊子撕开肝包膜，轻柔地钝性粉碎肝脏后再第二次消化肝脏，消化液为：Hanks液中含Ⅳ型胶原酶0.05 ％（W/V)、蛋白酶 E 0.02％， HEPES 10mmol/L，37℃，pH7.4，振动消化20min,其间补充少量无菌的5％NaHCO3 ,以免pH过低影响消化结果。第二次消化结束后，分别用80目和120目尼龙网过滤细胞悬液。 滤液离心450g， 7min,细胞沉淀在Hanks液中悬浮，体积10ml，与20ml18 ％ （W/V）、的Nycodenz混匀。此时将30ml与Nycodenz混合的细胞悬液分置数个离心管中，上覆Hanks液，进行密度梯度离心1450g，17min.离心后取界面细胞，在DMEM培养基中悬浮，再次离心450g，7min,洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于含胎牛血清20 ％的DMEN和IMDM的混合培养基中（V/V=1:1）。可用胎盼蓝染色判断细胞的存活率并计算产率。一般体重400g以上的大鼠肝星状细胞产率约1-10）×107个细胞，存活率＞95%。 （二）Stractan（阿拉伯半聚乳糖）密度梯度离心法 Stractan的制备：将450g粗制的Stractan粉剂溶于400ml蒸馏水。在4 ℃下分别将上述溶液用各900g的Amberlite 1RA-120阳离子交换树脂和1RA-410阴离子交换树脂搅拌30min以去除离子。然后经过滤漏斗除去溶液中的离子交换树脂。 Stractan溶液与BSG缓冲液2:1混合，最终经添加固体NaCl将溶液的渗透压调至290-295mOsmol/L；pH为7.4， Stractan的贮存液在35-40 ％的浓度范围，于-20 ℃保存。 具体的分离方法是用75mlL-15盐溶液原位灌洗肝脏，10ml/min，37 ℃，然后用100mlHanks改良的DMEM其中含0.2 ％蛋白酶E灌注，再循环灌注含0.015 ％的胶原酶的H/DMEM约25min。第二次消化肝脏时省去了胶原酶，用100ml H/DMEM含0.02 ％蛋白酶E和10μg/mlDNase 37 ℃下振荡消化30min左右。细胞悬液用纱布过滤，离心500g，7min总共