Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡及AD细胞模型建立 作者:白燕.doc
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Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡及AD细胞模型建立
白燕1,2,屈秋民(通讯作者),石婕
(1西安交通大学医学院,西安 710061;2西安医学院护理系,西安710021)
【摘要】
目的 探讨Aβ25-35对PC-12细胞凋亡的影响及建立阿尔茨海默病细胞模型的适宜条件。方法 以不同浓度Aβ25-35诱导PC-12细胞,并于多时间点观察细胞形态改变、应用MTT测定细胞活力以及检测细胞凋亡情况。结果 PC-12细胞在不同浓度Aβ25-35诱导下细胞活力均有不同程度下降(P≤0.05)。结论 Aβ25-35可诱导PC-12细胞活力呈时间和剂量依赖性下降及细胞凋亡,可认为20μmol/L Aβ25-35干预24小时可作为较理想的AD细胞型。
关键词:β-淀粉样蛋白;PC-12细胞;AD
随着社会老龄化,阿尔茨海默病(AD)作为老年人群中常见的神经退变性疾病,对人类生活质量的影响日趋明显。AD以大脑皮质获得性高级功能受损为主要临床特征,β淀粉样蛋白(amyloid beta protein Aβ)及其聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病特异性病理学变化,被认为是AD发病的重要环节和各种病因的共同通路[1]。本研究拟通过Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡以明确AD细胞模型的适宜条件。
材料与方法
一、材料
1.试剂Aβ25-35、二甲基亚矾(DMSO)和四甲基偶氮唑盐(MTT)均为美国Sigma公司产品;其余均为国产分析纯试剂。
2.仪器 倒置相差显微镜由日本Olympus 公司购进;恒温CO2培养箱美国Thermo公司FACSCalibur流式细胞仪由美国Becton Dicknson公司10%胎牛血清
浓度(μmol/L) 样本量 细胞活力(%) 1 4 89.46±2.32* 10 4 58.72±3.53* 20 4 52.01±2.64* 50 4 42.27±4.29* 100 4 33.41±4.18* *注:与对照组比较,P0.05
2、细胞形态观察 在倒置显微镜下,刚接种的PC12细胞为散在分布的透亮且体积较小圆形细胞,经培养12小时后大部分细胞贴壁且长出短小突起。24小时后细胞为梭形,边界清楚,胞浆丰富。在 Aβ作用下出现细胞凋亡增加,表现为胞体缩小变圆,边界模糊,细胞核固缩,细胞突起中断。随着处理的时间增加,细胞胞体变小,呈空泡状,突起完全消失(见图1)。
图1 Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡细胞形态(×400)
A:10μmol/L(24h) B:20μmol/L(24h) C:50μmol/L(24h)
3、Aβ对PC12细胞凋亡率的影响 20μmol/L Aβ干预6、12、24小时后测定PC12细胞凋亡。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组细胞集中在3区,凋亡率为2.17±0.21%;20μmol/L Aβ作用6小时后出现明显细胞凋亡,12小时后凋亡率为6.21±0.32%;24小时达17.43±0.64%,并出现坏死细胞。Aβ的细胞毒性作用随时间随着培养时间的延长呈现增长趋势(见图2)。
正常对照组
20μmol/L(12h)
20μmol/L(24h)
图2 Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡
讨论
由于AD发病机制未明,因此对AD仍缺乏有效的治疗措施。建立良好的AD模型有助于从细胞和分子水平进一步对阿尔茨海默病进行研究,从而为揭开AD的发病机制并为治疗提供依据。
Aβ是构成AD特征性病变SP的核心成分,由39~43个氨基酸组成,是由β-淀粉样前体蛋白(APP)在β-和γ-蛋白酶作用下水解形成的。诱导细胞凋亡是Aβ细胞毒性作用的重要环节[2]。研究结果显示,Aβ1-40作用可下调体外培养的原代海马神经元bcl-2的表达,上调bax的表达,导致细胞色素C释放以及细胞色素C能活化caspase-3引起级联反应,引起神经细胞凋亡[3]。此外,研究发现Aβ可通过激活诱导细胞凋亡P53表达,使神经元出现P53依赖性细胞凋亡 [4]。
PC12细胞株从大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞克隆化而来,细胞呈多角型,贴壁生长,易聚集成团,具有神经内分泌特性[5]。PC12细胞株与原代培养的细胞相比更易获得,细胞生存时间长,传代稳定,易于观察,是较理想AD体外模型之一。
本研究表明,不同浓度Aβ作用于PC-12细胞后,出现典型的凋亡特征,细胞活力逐渐下降。其细胞活力呈时间和剂量依赖性下降趋势,当浓度为20μmol/L时,24小时渐达到凋亡高峰,呈典型凋亡特征。适于在此浓度和时间点在建立细胞模型用于AD研究。
参考文献
HARDY J., ALLSOP D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimers dis
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