Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡及AD细胞模型建立 作者：白燕.doc

Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡及AD细胞模型建立 白燕1，2，屈秋民（通讯作者），石婕 （1西安交通大学医学院，西安 710061；2西安医学院护理系，西安710021） 【摘要】 目的　探讨Aβ25-35对PC-12细胞凋亡的影响及建立阿尔茨海默病细胞模型的适宜条件。方法　以不同浓度Aβ25-35诱导PC-12细胞，并于多时间点观察细胞形态改变、应用MTT测定细胞活力以及检测细胞凋亡情况。结果　PC-12细胞在不同浓度Aβ25-35诱导下细胞活力均有不同程度下降（P≤0.05）。结论　Aβ25-35可诱导PC-12细胞活力呈时间和剂量依赖性下降及细胞凋亡，可认为20μmol/L Aβ25-35干预24小时可作为较理想的AD细胞型。 关键词：β-淀粉样蛋白；PC-12细胞；AD 随着社会老龄化，阿尔茨海默病(AD)作为老年人群中常见的神经退变性疾病，对人类生活质量的影响日趋明显。AD以大脑皮质获得性高级功能受损为主要临床特征，β淀粉样蛋白(amyloid beta protein Aβ)及其聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病特异性病理学变化，被认为是AD发病的重要环节和各种病因的共同通路[1]。本研究拟通过Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡以明确AD细胞模型的适宜条件。 材料与方法 一、材料 1.试剂Aβ25-35、二甲基亚矾(DMSO)和四甲基偶氮唑盐(MTT)均为美国Sigma公司产品；其余均为国产分析纯试剂。 2.仪器 倒置相差显微镜由日本Olympus 公司购进；恒温CO2培养箱美国Thermo公司FACSCalibur流式细胞仪由美国Becton Dicknson公司10%胎牛血清 浓度（μmol/L） 样本量 细胞活力（%） 1 4 89.46±2.32* 10 4 58.72±3.53* 20 4 52.01±2.64* 50 4 42.27±4.29* 100 4 33.41±4.18* *注：与对照组比较，P0.05 2、细胞形态观察 在倒置显微镜下，刚接种的PC12细胞为散在分布的透亮且体积较小圆形细胞，经培养12小时后大部分细胞贴壁且长出短小突起。24小时后细胞为梭形，边界清楚，胞浆丰富。在 Aβ作用下出现细胞凋亡增加，表现为胞体缩小变圆，边界模糊，细胞核固缩，细胞突起中断。随着处理的时间增加，细胞胞体变小，呈空泡状，突起完全消失(见图1)。 图1 Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡细胞形态（×400） A：10μmol/L(24h) B：20μmol/L(24h) C：50μmol/L(24h) 3、Aβ对PC12细胞凋亡率的影响　20μmol/L Aβ干预6、12、24小时后测定PC12细胞凋亡。流式细胞仪检测结果显示，正常对照组细胞集中在3区，凋亡率为2.17±0.21%；20μmol/L Aβ作用6小时后出现明显细胞凋亡，12小时后凋亡率为6.21±0.32%；24小时达17.43±0.64%，并出现坏死细胞。Aβ的细胞毒性作用随时间随着培养时间的延长呈现增长趋势(见图2)。 正常对照组 20μmol/L(12h) 　20μmol/L(24h) 图2 Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡 讨论 由于AD发病机制未明，因此对AD仍缺乏有效的治疗措施。建立良好的AD模型有助于从细胞和分子水平进一步对阿尔茨海默病进行研究，从而为揭开AD的发病机制并为治疗提供依据。 Aβ是构成AD特征性病变SP的核心成分，由39～43个氨基酸组成，是由β-淀粉样前体蛋白(APP)在β-和γ-蛋白酶作用下水解形成的。诱导细胞凋亡是Aβ细胞毒性作用的重要环节[2]。研究结果显示，Aβ1-40作用可下调体外培养的原代海马神经元bcl-2的表达，上调bax的表达，导致细胞色素C释放以及细胞色素C能活化caspase-3引起级联反应，引起神经细胞凋亡[3]。此外，研究发现Aβ可通过激活诱导细胞凋亡P53表达，使神经元出现P53依赖性细胞凋亡 [4]。 PC12细胞株从大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞克隆化而来，细胞呈多角型，贴壁生长，易聚集成团，具有神经内分泌特性[5]。PC12细胞株与原代培养的细胞相比更易获得，细胞生存时间长，传代稳定，易于观察，是较理想AD体外模型之一。 本研究表明，不同浓度Aβ作用于PC-12细胞后，出现典型的凋亡特征，细胞活力逐渐下降。其细胞活力呈时间和剂量依赖性下降趋势，当浓度为20μmol/L时，24小时渐达到凋亡高峰，呈典型凋亡特征。适于在此浓度和时间点在建立细胞模型用于AD研究。 参考文献 HARDY J., ALLSOP D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimers dis