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第二章 微生物形态学 第一节 研究微生物的基本方法 微生物怎样确认？ （1）生命活动，培养后确认 （2）显微镜观察 微生物学的研究内容： （1）形态 （2）生理生化 （3）生态 微生物的研究方法 （1）显微镜观察法：原始、染色 （2）纯种分离 （3）培养及接种 （4）生理特性试验 一、显微镜观察法 微生物的显著特点之一是个体微小。 细菌 0.3～5－8～10 μm 放大1000倍 酵母 长 5?30 μm 宽 1?5 μm 放大200－400倍 1．压滴法––––观察活的微生物 多用于霉菌、酵母的观察 方法： 载玻片→－→挑种－→盖玻片覆盖－→显微镜观察 2、悬滴法 观察微生物的运动状态 方法： 盖玻片－→滴样－→反转盖玻片－→放在凹玻片上方－→固定－→培养－→镜检 3、染色法 目的：使被观察的微生物与背景色差增加，以利于观察。 用途： ①显示细胞结构、探查成分的性质、分布 ②鉴别细菌的种类； ③区别细胞的死活； ④粗略测定细菌的等电点。 （1）单染法 只用一种染料使微生物着色的方法称之 常见染料如美兰、龙胆紫、花红、蕃红等。 方法： 载玻片－→涂片－→干燥－→固定－→染色－→水洗－→干燥－→镜检 Note：若观察活菌时，则不需固定。 要求：①涂片要均匀；②染色时间要准确。 例如：区别酵母细胞的死活（美兰法） 活细胞——代谢能力强，还原美兰为无色。 死细胞——代谢能力弱，不能还原美兰，染成兰色。 （2）复染色法 使用两种或两种以上的染色剂使微生物染色的方法，称为复染色法。 ① 革兰氏染色法，1884年丹麦医生G. Gram首先使用，以后多次改良。 使用三种染色剂：草酸铵结晶紫，路哥氏碘液，蕃红，可以用来鉴别细菌，又称鉴别染色法。 细菌－→革兰氏染色： G（＋） 阳性 兰色 G（－） 阴性 红色 ② 抗酸染色法 ——鉴别结核杆菌 染色剂 石炭酸复红、碱性酒精（脱色）、美兰 微生物－→ 抗酸染色法 红色，抗酸性微生物 兰色，非抗酸性微生物 另外，特殊染色法——芽孢、荚膜、鞭毛染色等。 显微镜观察微生物是微生物学的基本技能，必须掌握 二、微生物的纯种分离 纯种分离——从混合的微生物群体中分离出一种微生物的过程。 常见方法四种： 平板划线法 稀释平板法 特殊培养基法 单细胞分离法 1、平板划线法 范围：常用来分离酵母、细菌等微生物 方法：用无菌的接种环取一环菌液，在固体培养基表面划线，在划线过程中使其在平板上稀释，使微生物细胞分散在平板上，由细胞在平板上长出菌落。从一个细胞形成的菌落，可以为单纯的菌落。 实际应用时，以该过程进行多次重复。 划线操作：扇形；连续；方格 平行；“之”形 2、稀释分离法 范围：适于所有微生物的分离。 方法：通过不断的稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取稀释样品注入平板，涂匀于平板表面，则分离的微生物被固定在原处而生成菌落。 实验为操作方便一般采用 9.0 ml无菌水(生理盐水)+1.0 ml样品液。 或者:4.5+0.5;99+11,19+1等 3、特殊培养基培养分离法 范围：适于所有微生物 （1）选择培养基 培养基中一些组成分对某些微生物有抑制或促进作用，从而使其与其它微生物区别开来。 例如：革兰氏阳性细菌G（+）可被碘液抑制，G（－）细菌生长出来。 （2）鉴别培养基 鉴别培养基的特殊成分使微生物的菌落呈现特征，则使于识别和挑选。 4、单细胞分离法 范围：霉菌、酵母、原生动物等个体较大的微生物。 工具：单细胞分离操作器。 原理：在显微镜下挑取分散的单个细胞，然后培养，达到分离的目的。 Note：纯种分离时的方法应用经常联合使用，如3和2联合使用等，可以提高分离效果。 三、接种和培养 接种——用微生物菌种或含菌材料将微生物转移到新鲜培养基上的过程。 培养——微生物在适当条件下于营养基质中生长繁殖的过程。 1、微生物的接种方法： （1）涂布法：固体培养基表面，均匀涂布。 （2）划线法：固体培养基表面，斜面划线、平板划线 （3）点种法：固体培养基表面，局部点种。 （4）穿刺法：固体培养基内部，点穿刺、线穿刺。 （5）浸洗法：液体培养基 （6）活体接种：医学上常用，采用动物培养病原菌 动物接种、离体活组织接种等 鸡胚胎接种：检