荧光定量PCR实验操作流程.ppt

荧光定量PCR 北京康为世纪生物科技有限公司 细胞RNA提取 样品：293T细胞 试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇 方法：柱式 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离。 细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml RLT； 反复吹打，使样本充分裂解； 室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离 1. 裂解： 2. 抽提： 加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min； 4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，此时样品分为三层； 上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相， RNA在上层水相中 细胞RNA提取 3. 过柱子： 吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱（SpinColumn RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中； 4. 洗涤： 向吸附柱加入700 μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干； 细胞RNA提取 5. 洗涤： 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min， 收集RNA溶液，进行后续试验或-70℃保存RNA，防止降解。 注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。  2）若提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤5。  3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。 6. RNA检测： 用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定； 测定样品纯度和浓度。 纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 1.8 蛋白质或酚类污染 2.2 RNA水解 浓度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀释倍数 细胞RNA提取 逆转录 实验材料：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，RNA 实验步骤： 1. 将 RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和 RNase- Free Water溶解并置于冰上备用。 2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。 试剂 20 μl 反应体系 dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl Primer Mix 2 μl RNA Template 2 μl 5×RT Buffer 4 μl DTT，0.1 M 2 μl HiFi-MMLV，200 U/μl 1 μl RNase-Free Water 5 μl 3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 4. 42℃孵育30~50分钟，70℃孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20℃长期保存。 逆转录 荧光定量PCR 材料：2×UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物 实验步骤： 1. 稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。 编号 模板稀释倍数 水用量 模板用量 1 1倍 0ul 原液 2 10倍 45 μl 5 μl （从1号管取） 3 100倍 45 μl 5 μl（从2号管取） 4 1000倍 45μl 5 μl（从3号管取） 5 10000倍 45 μl 5 μl（从4号管取） 6 45ul 对照 2. 配制PCR预混反应体系： 做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下： 试剂 配制的8个孔的预混体系 20 μl反应体系 2×UltraSYBR Mixture 80 μl 10 μl Forward Primer，10 µM 6.4 μl 0.