《微生物代谢调控》课件资料.ppt

*************************************氧化应激反应活性氧检测微生物通过特定的感受系统检测细胞内活性氧水平的升高。在大肠杆菌中，OxyR和SoxRS是两个主要的氧化应激响应调控因子。OxyR：响应H?O?的存在SoxRS：响应超氧阴离子抗氧化酶系统为了消除有害的活性氧，微生物合成多种抗氧化酶。每种酶针对特定类型的活性氧发挥作用。超氧化物歧化酶：转化O??为H?O?过氧化氢酶：分解H?O?为H?O和O?过氧化物还原酶：还原有机过氧化物非酶抗氧化系统除了酶系统外，微生物还依赖小分子抗氧化剂来中和活性氧，保护细胞组分免受氧化损伤。谷胱甘肽：主要细胞内抗氧化剂硫氧还蛋白：维持蛋白质巯基的还原状态类胡萝卜素：清除单线态氧代谢工程的基本概念代谢途径优化通过基因修饰改变代谢流分布，增强目标产物合成途径，减少副产物形成。代谢途径优化可能涉及过表达限速酶、敲除竞争途径、引入异源基因等策略。随着合成生物学的发展，甚至可以构建自然界中不存在的全新代谢途径。调控系统改造修改微生物的代谢调控网络，使其适应工业生产需求。这包括改变转录因子、启动子强度、核糖体结合位点等元件，或引入人工调控系统。调控系统改造的目标是使目标基因在合适的时间和水平表达，最大化产物产量。底盘细胞改造改造微生物的基础代谢网络，创造更适合作为生物工厂的底盘细胞。这可能涉及简化基因组、提高能量效率、增强抗逆性等。理想的底盘细胞应具有生长稳定、代谢效率高、遗传操作简便等特点，便于进一步改造。代谢流分析代谢流的定义代谢流是指单位时间内通过特定代谢反应或代谢途径的物质量。它反映了代谢网络中物质流动的速率和方向，是研究代谢活动动态特性的重要参数。代谢流分析的目的是定量描述微生物体内各代谢反应的速率，揭示代谢网络的整体运行状态，为代谢工程提供理论依据。代谢流分析方法约束型代谢流分析：基于稳态假设和质量平衡原理，结合线性规划算法，计算出符合约束条件的可能代谢流分布。13C代谢流分析：利用13C标记底物培养微生物，测定代谢中间产物中同位素分布模式，通过数学建模推算代谢流分布。动态代谢流分析：针对非稳态条件，通过测量代谢物浓度随时间的变化，结合动力学模型估算代谢流。代谢通量分析糖酵解三羧酸循环磷酸戊糖途径氨基酸合成核苷酸合成其他途径代谢通量分析是研究微生物代谢网络中物质和能量流动的重要工具。通过测定关键代谢物的浓度变化率和同位素标记模式，结合数学模型，可以计算出代谢网络中各反应的通量大小和方向。这种分析能够揭示微生物在特定条件下代谢活动的全貌。如上图所示，在典型的需氧条件下，大肠杆菌葡萄糖代谢中，大部分碳流通过糖酵解和三羧酸循环，而磷酸戊糖途径和生物合成途径消耗较少比例的碳源。代谢通量分析不仅能反映野生型微生物的代谢特性，还能评估基因工程改造后代谢网络的重构情况，为进一步的代谢工程提供指导。基因工程在代谢调控中的应用目标途径分析确定需要调控的代谢途径和关键酶通过文献研究确定限速步骤利用代谢流分析识别调控节点预测基因改造对代谢网络的影响基因编辑设计设计基因操作策略以实现期望的调控效果过表达关键酶基因增强目标通路敲除副产物途径减少碳源流失修改调控元件优化基因表达模式基因组操作执行基因编辑并筛选成功的改造菌株利用CRISPR-Cas9等技术进行精确编辑构建表达载体导入外源基因应用定点整合技术确保基因稳定表达表型验证评估基因改造对代谢的实际影响测定目标产物产量和产率分析代谢中间产物变化评价工程菌生长特性和稳定性基因敲除技术靶点选择确定需要敲除的目标基因构建载体设计含同源臂的敲除载体转化细胞将敲除载体导入宿主细胞同源重组通过双交换替换目标基因筛选验证筛选并确认敲除成功的菌株基因敲除技术是代谢工程中常用的策略，通过删除特定基因来阻断不需要的代谢途径或去除负调控因子。传统的基因敲除依赖同源重组，需要构建含有抗性标记的敲除载体，并通过两次筛选获得目标突变。而现代基因敲除技术如CRISPR-Cas9系统则大大提高了敲除效率和精确度。在代谢调控中，基因敲除可用于：1)消除副产物合成途径，增加目标产物产量；2)移除调控抑制因子，解除代谢途径的限制；3)阻断细胞生长必需途径，实现毒性基因条件控制系统。合理使用基因敲除技术需要充分了解目标菌株的代谢网络，预测敲除可能带来的全局影响。基因过表达技术质粒表达系统利用高拷贝或低拷贝质粒载体实现目标基因的过表达。这些载体通常包含强启动子、优化的核糖体结合位点和转录终止子。根据需要可选择组成型表达或诱导型表达系统。常用的诱导系统包括I