塞来昔布治疗裸鼠前列腺癌骨转移的研究.doc

塞来昔布治疗裸鼠前列腺癌骨转移的研究 　　【摘要】 目的 建立裸鼠前列腺癌骨转移模型，探讨塞来昔布作为血管抑制剂对前列腺癌骨转移的形成及生长的影响。方法 将30只前列腺癌骨转移裸鼠随机分成二组，第一组隔日予以生理盐水，腹腔注射；第二组隔日予以塞来昔布30 mg/kg，腹腔注射； 30 d后处死。检测血清碱性磷酸酶，采用免疫组化和图象分析系统测定血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤微血管密度(MVD)，光镜下观察各组肿瘤组织,流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果 治疗组肿瘤的生长明显受到抑制(P0.01)，塞来昔布组肿瘤组织中的VEGF和MVD与对照组比较无统计学意义(P0.01)，抑瘤率为54.47%，凋亡指数由(4.68±1.83)%上升到(24.93±6.14)%，血清碱性磷酸酶由(26.5±4.93)U/L下降到(17.17±3.13)U/L。结论 塞来昔布能显著抑制裸鼠前列腺癌骨转移瘤的生长和新生血管形成。? 　　【关键词】 塞来昔布；前列癌骨转移 　　? 　　作者单位：332000九江市第一人民医院骨外科 　　 　　骨是前列腺癌转移的好发部位，约80％的前列腺癌的患者发生骨转移，其机理尚未完全明确，但肿瘤的生长及转移与血管生成密切相关的理论已得到公认1］。塞来昔布是一种新型的非甾体类抗炎药，因具有抗血管生成及诱导肿瘤细胞凋亡的作用而引起人们的关注。关于其单独应用对前列腺癌骨转移瘤生长影响的研究目前尚未见报道，本实验对此进行初步探讨。? 　　 　　1 材料和方法? 　　1.1 主要试剂和材料 　　blab?c种系裸鼠，SPF级，鼠龄4~8周，雌性，体重15~20 g，共30只，购于湖北省防疫站，在武汉大学动物实验中心SPF环境中饲养。人前列腺癌细胞系PC?3购于中科院武汉生物保存中心。VEGF抗体、鼠抗人Ⅷ因子抗体购于北京中山公司。? 　　1.2 前列腺癌骨转移动物模型建立2］ 　　前列腺癌单细胞悬液采用PC?3细胞，用PBS调节细胞浓度到1×10??7?个/ml。裸鼠用戊巴比妥钠麻醉,75%乙醇消毒股骨及胫骨处皮肤后，用4.5号针头直接于股骨髁上刺透骨皮质,然后将针尖插入骨干内注入0.1 ml的单细胞悬液。? 　　1.3 动物分组与标本处理 　　将接种之后的裸鼠30只随机分为2组，每组15只。24 h后给药，第一组(对照组)：隔日腹腔注射生理盐水；第二组(塞来昔布组)：隔日腹腔注射塞来昔布30 mg/kg。30 d后断颈处死裸鼠，处死之前每只摘眼球放血以检测血清碱性磷酸酶的含量；脊椎离断处死后连同包膜完整剥出肿瘤组织，电子天平称重，游标卡尺测量肿瘤长径和短径，按下列公式计算体积和抑瘤率。? 　　V=a×b??2?/2(V代表肿瘤体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)? 　　抑瘤率=(对照组肿瘤体积?实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%? 　　1.4 免疫组织化学染色及结果判断 　　肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定24 h，石蜡包埋，连续切片(4 μm)，行VEGF和MVD免疫组化染色,以PBS代替一抗作阴性对照。? 　　1.4.1 VEGF判断标准 高倍镜视野下计数100个细胞，胞浆棕黄的阳性细胞少于5%为阴性，多于或5%为阳性。采用病理教研室CMIAS真彩图形分析系统对VEGF的表达进行定量分析。? 　　1.4.2 MVD判断标准3］ 选用40×镜扫视整个切片，寻找高血管密度区，然后计数1个200×视野的染成棕色的血管环(条)数目(任何染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，只要它和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就把它看作1个微血管。由两名高年资病理医师分别计数3个200 视野下的血管数目，取两者的平均值)。? 　　1.5 流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡 　　新鲜的肿瘤组织采用EDTA螯合法制备成单细胞悬液。然后经70%乙醇固定，过滤，离心，PI染色，在流式细胞仪上用MultiCycle for Windows软件作细胞周期分析。? 　　1.6 统计学处理 　　所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，各组均数比较采用单向方差分析，P0.05表示差异有统计学意义，数据采用SPSS 11.5统计软件分析。? 　　 　　2 结果? 　　2.1 各组鼠重、瘤重及肿瘤体积大小 　　对照组肿瘤体积20 d后增长明显；塞来昔布组则增长缓慢，24 d后肿瘤几乎处于停滞状态，体积无明显变化。实验结束时各组鼠重、瘤重、肿瘤体积见表1。裸鼠体重方面：术后3 d称重，两组中均有部分裸鼠体重下降，到术后一周基本恢复到术前水平。两组裸鼠平均体重在实验前后改变差异无统计学意义(P0.05)。瘤重方面：治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P0.01)。肿瘤体积方面：治疗组与对照组比较