零背景转座技术高效构建重组家蚕杆状病毒表达系统 期刊.pdf

Short Co mmunicatio n 　　 研究简报 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica ( ) 49 6 : 831 - 837 ; 4 June 2009 ISSN 0001 - 6209 ; CN 11 - 1995Q http :journals. im. ac . cnactamicrocn 零背景转座技术高效构建重组家蚕杆状病毒表达系统 1 1 ,2 1 ,3 1 1 ,2 姚伦广 ,张红玲 ,冯娟 ,张二辉 ,文祯中 (1 中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室 , 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室 ,南阳师范学院生物科学与技术学院 ,南阳 473061) (2 河南师范大学生命科学学院 ,新乡 453007) (3 河南农业大学生命科学学院 ,郑州 450002) ( ) 摘要 :【目的】获得零转座背景的基于家蚕核型多角体病毒 B ombyx mori Nucleopolyhedrovirus , BmNPV Bacto γ Bac 系统 ,为高效经济构建重组BmNPV 在家蚕体内表达 目标蛋白提供新系统 。【方法】利用 R6K 作为复制 ( ) ( 子构建新的条件复制型杆状病毒转移载体 pRADM , 同时封闭BmNPVBacmid BmBacmid 宿主菌 Escherichia coli BmDH10Bac) 的 Tn7 转座受体位点 attTn7 ,获得新的封闭型宿主菌 E . coli BmDH10Bac △Tn7 。【结果】由于 pRADM 无法在宿主菌 E . coli BmDH10Bac 中复制 ,封闭了 attTn7 位点的宿主菌也不能再和 BmBacmid 竞争与 转移载体的重组 ,显著提高了转座效率 。封闭宿主菌的 attTn7 位点 ,能使转座效率提高近 4 倍 ,使用条件复 制型转座载体 pRADM 时 ,转座效率提高近 10 倍 。而用 pRADM 转座 E . coli BmDH10Bac △Tn7 时 ,转座阳性 率为 100 % 。避免了获得重组病毒 DNA 的鉴定程序 ,缩短了获得重组蛋白所需时间。用携带红色荧光蛋白 基因DsRed 的重组质粒 pRADMRed 转座 E . coli BmDH10Bac △Tn7 ,获得重组BmBacmid 转染 BmN 细胞 ,红色 荧光蛋白在细胞中得到高效表达 。【结论】结果表明pRADM 和 E . coli BmDH10Bac △Tn7 是一种零背景高效 构建重组BmNPV 的新系统 。 关键词 : 条件复制子 ;零背景转座 ;重组家蚕核型多角体病毒 中图分类号 : Q786 　　文献标识码 :A 　　文章编号 (2009) ( ) 　　自Smith 等 1983 利用杆状病毒表达系统高效 细胞 中进行外源基 因表达 。另一种就是 BmNPV β [ 1] ( ) ( 表达人 干扰素 ,特别是 Luckow 等 1993 发展了 B ombyx mori Nucleopolyhedrovirus ,