蛋白质相互作用多种方法.pptx

蛋白质互相作用多种办法;Protein interaction：two or more proteins (same or different) interact or form complex; 人类蛋白质组相用;蛋白质互相作用： 本身具有生物学意义：这样互相作用在生物体中是起什么作用 发展技术：利用这样互相作用发明出某些人为作用 ;利用生物信息学办法由繁入简;;酵母蛋白质互相作用联系图;研究蛋白质互相作用目标是发觉并明确其互相作用生物学意义 蛋白质互相作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质互相作用关键 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反应了遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适研究办法 ;研究蛋白质互相作用需要微观和宏观结合; 研究蛋白质互相作用意义 1、蛋白质间互相作用是细胞生命活动基础。 2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是发挥作用主体。蛋白质互相作用是发挥其功能主要活动。;;研究蛋白质互相作用是为了研究对应生物学功能;从蛋白质互相作用到生物学功能。利用蛋白质直接互相作用，发觉互相作用蛋白质，再分析这些作用生物学意义。 容易犯错误：研究一大堆蛋白互相作用，却不懂得这些互相作用有什么生物学意义。 从生物学功能到蛋白质互相作用。通过变化生物学现象，分析蛋白质间遗传互相作用，深入研究有关蛋白质互相作用。 容易犯错误：找到了平行变化不有关蛋白质。;; 免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation，CO-IP） 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在许多蛋白质－蛋白质间互相作用被保存了下来。假如用蛋白质X抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合蛋白质Y也也许沉淀下来。蛋白质Y沉淀是基于与蛋白质X物理性互相作用，称为免疫共沉淀。 ;Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质存在是否。 免疫共沉淀：非变性抗原，用于判定不一样蛋白质间互相作用。多采取非离子变性剂（NP40或Triton X-100) ;免疫共沉淀检测蛋白质原理和常见问题;试验过程;试验过程;实 验关键;主要用于： 两种感爱好蛋白质是否在体内存在互相作用； 也用于判定一种特定蛋白质未知互相作用蛋白。 注意： 1 要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不变。??于出现假阳性概率比较高。 2 设置对照：在对照组中使用对照抗体，以缺失目标蛋白细胞系作为阴性对照等等。 ;Western blot; 长处： 1、互相作用蛋白质都是经翻译后修饰，处于天然状态； 2、蛋白互相作用是在自然状态下进行，能够避免人为影响； 3、能够分离得到天然状态互相作用蛋白复合物。 ;缺陷： 1、也许检测不到低亲和力和瞬间蛋白质－蛋白质互相作用； 2、两种蛋白质结合也许不是直接结合，而也许有第三者在中间起桥梁作用； 3、如用western blot检查，必须在试验前预测目标蛋白是什么，以选择最后检测抗体，若预测不正确，试验就得不到成果，办法本身具有冒险性，敏捷度不如亲和色谱高。 ; GST pull-down技术 1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白,从此GST融合蛋白在研究蛋白质互相作用领域得到极大推广(His也常用)。 此办法是一种行之有效验证酵母双杂交系统体外试验技术。还应当在体内用单独办法，如免疫共沉淀加以证明。 ; 靶蛋白X基因亚克隆到带有GST基因原核体现载体中，并在细菌中体现GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探针、诱饵蛋白)挂到带有GST底物Sepharose beads上，然后把另一种含目标蛋白质（捕捉蛋白）溶液加入其中。由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如发生互相作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀搜集下来，洗脱非特异结合蛋白后采取SDS判定与诱饵蛋白质互相作用蛋白质。;GST-Pull down Assay;GST pull down;GST pull down;检测GST融合蛋白与靶蛋白互相作用： 1、放射性标识融合蛋白：迅速简单易行 2、抗GST抗体检测 3、生物素标识融合蛋白：没有放射性，但也许对探针蛋白和其他蛋白互相作用有影响。 ;应用： 一确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间新互相作用； 一是判定两个已知蛋白质之间是否存在互相作用。;特点： 比较简便，假如用抗GST抗体检测或生物素标识融合蛋白避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质互相作用研究中有很广泛应用。 融合蛋白具有高通量性、高选择性特点，由于融合蛋白