猪流行性腹泻病毒N蛋白纳米抗体的筛选与鉴定.pdf
摘要
猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine
epidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的一种急性高度接触性胃肠道传染病。临床上以
腹泻、呕吐、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征，尤其是对7日龄内的仔猪，病死
率可高达100%，给世界养猪业造成巨大的经济损失。然而，目前PEDV疫苗的免疫
效果低下并且没有针对PEDV的特效药。因此，快速、高通量检测对于诊断和监测
PEDV流行并提供最新的疾病信息以控制传播发挥重要作用。PEDVN基因在不同分
离株中保守性高，且在感染早期，体内抗N蛋白的抗体水平最高。所以N蛋白可作
为建立PEDV分子诊断工具的优选蛋白。纳米抗体（Nanobody，Nb）具有亲和力高、
反应能力强、稳定性高且容易批量生产等特点。因此，本研究拟采用噬菌体展示技术
获得针对PEDVN蛋白的特异性Nb，并对Nb的生物特性进行初步研究，为建立PEDV
的检测方法奠定物质基础。
试验方法如下：（1）构建PEDVN蛋白原核表达载体，进行表达纯化。（2）使
用PEDVN蛋白免疫羊驼，间接ELISA测定IgG抗体效价，利用巢氏PCR方法并结
合噬菌体展示技术构建噬菌体展示文库。（3）以PEDVN蛋白作为靶向蛋白，对文
库进行淘选，滴度试验监测富集情况；通过噬菌体ELISA筛选阳性噬菌体，获得Nb
氨基酸序列；（4）构建Nb原核表达载体，进行表达纯化，并通过间接ELISA鉴定
Nb的特异性和结合力。
结果显示：（1）原核表达并纯化获得浓度为1.246mg/mL，具有良好反应原性
的可溶性PEDVN蛋白。（2）测定羊驼体内IgG效价为1:102400，构建了噬菌体展
810
示文库，文库的库容为4.72×10，丰度为4.3×10cfu/mL，阳性率为93.75%。（3）
经过四轮筛选，筛选出48个阳性单克隆，经测序分析获得16株Nb氨基酸序列。（4）
筛选并表达出一株具有良好特异性和结合能力的Nb-Nb45。
本研究构建了高度多样性的噬菌体展示文库，通过噬菌体展示技术筛选，得到具
有良好特异性和结合能力的Nb45，为诊断PEDV新方法的建立提供生物材料和技术
支撑。
关键词：猪流行性腹泻病毒；N蛋白；纳米抗体；原核表达；噬菌体展示
II
目录
第一章绪论1
1.1猪流行性腹泻概述1
1.1.1临床特征1
1.1.2传播途径1
1.1.3国外流行现状1
1.1.4国内流行现状2
1.2猪流行性腹泻病毒分子病原学2
1.2.1S蛋白2
1.2.2M蛋白3
1.2.3E蛋白3
1.2.4N蛋白3
1.3猪流行性腹泻的诊断方法4
1.3.1病原学诊断方法4
1.3.2免疫学诊断方法5
1.3.3分子生物学方法6
1.4猪流行性腹泻的防控7
1.5纳米抗体概述7
1.6纳米抗体的结构特征8
1.7纳米抗体的特性9
1.7.1分子小、可溶性好、结构稳定9
1.7.2亲和力较高9
1.7.3免疫源性弱9
1.7.4易生产、易纯化10
1.8纳米抗体的应用10
1.9研究目的与意义11
第二章材料与方法12
2.1