猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用.docx

中国兽医科学２０１４，４４（１２）：１２６２－１２６７ＣｈｉｎｅｓｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ中图分类号：Ｓ８５２．６５９．６文献标志码：Ａ文章编号：１６７３－４６９６（２０１４）１２－１２６２－０６猪流行性腹泻病毒抗原捕获ＥＬＩＳＡ抗体检测方法的建立与应用时晓丽，谈晨，赵攀登，白娟，李玉峰，姜平＊（南京农业大学 农业部动物细菌学重点实验室 ，江苏 南京２１００９５）摘要：用猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）Ｎ蛋白单克隆抗体ＩｇＧ包被酶标板，以纯化的ＰＥＤＶ作为捕获抗原，建立了ＰＥＤＶ抗原捕获ＥＬＩＳＡ 抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为：单克隆抗体包被浓度为２μｇ／ｍＬ，３７℃包被２ｈ加４℃过夜；含５０ｇ／Ｌ脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液，３７℃封闭３ｈ；捕获抗原的质量浓度为５μｇ／ｍＬ，３７℃作用３ｈ；被检猪血清做１∶５０稀释，３７℃作用１ｈ；山羊抗猪ＩｇＧ－ＨＲＰ稀释度为１∶２０００，３７℃作用４５ｍｉｎ；底物最佳作用时间为３７℃１０ｍｉｎ。设定阴阳性血清抗体对照，计算血清样品的Ｓ／Ｐ值，Ｓ／Ｐ值≥０．３７判为阳性，Ｓ／Ｐ值＜０．３２３判为阴性，介于两者之间为可疑。用建立的ＥＬＩＳＡ检 测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒２型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清，结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于１０％。 相对国产商品化抗体检测试剂盒，其敏感性、特异性和符合率分别为９４．６％、９１．３％和９３．３％。应用本方法检测山东 、浙江和江苏省的３０８份猪血清样品，结果ＰＥＤＶ抗体阳性率达８９．２９％。结果表明，建立的抗原捕获ＥＬＩＳＡ 敏感性、特异性和重复性良好，可用于 ＰＥＤＶ 抗体检测和流行病学调查。关键词：猪流行性腹泻病毒；抗原捕获ＥＬＩＳＡ；抗体ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎａｎｔｉｇｅｎｃａｐｔｕｒｅＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＳＨＩＸｉａｏ－ｌｉ，ＴＡＮ Ｃｈｅｎ，ＺＨＡＯ Ｐａｎ－ｄｅｎｇ，ＢＡＩＪｕａｎ，ＬＩＹｕ－ｆｅｎｇ，ＪＩＡＮＧＰｉｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎａｎｔｉｇｅｎｃａｐｔｕｒｅＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｕｓｉｎｇｐｕｒｉｆｉｅｄｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒ－ｒｈｅａｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ａｓｔｈｅｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｇｅｎａｎｄａｎａｎｔｉ－ＰＥＤＶ Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭｃＡｂ）ａｓｃｏａｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ．Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｃｏａｔｉｎｇ ＭｃＡｂｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓｓｅｔｔｏ２μｇ／ｍＬ，ａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ２ｈａｔ３７℃ａｎｄｏｖｅｒｎｉｇｈｔａｔ４℃；ｔｈｅｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒｗａｓ５０ｇ／Ｌｌｉｐｉｄ－ｆｒｅｅｍｉｌｋ，ａｎｄｔｈｅｂｌｏｃｋｉｎｇｔｉｍｅｗａｓ３ｈａｔ３７℃；ｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｇｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ５μｇ／ｍＬ，ａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ３ｈａｔ３７℃；ｐｉｇｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅｄｉｌｕｔｅｄ１∶５０，ａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ１ｈａｔ３７ ℃；ｇｏａｔａｎｔｉ－ｓｗｉｎｅＩｇＧ－ＨＲＰ ｗａｓｕｓｅｄａｔａｄｉｌｕｔｉｏｎｏｆ１∶２０００ａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ４５ｍｉｎａｔ３７ ℃．ＴｈｅＴＭＢｓｕｂｓｔｒａｔｅｗａｓａｄｄｅｄａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ１０ｍｉｎａｔ３７℃ ｂｅｆｏｒｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎ．ＵｓｉｎｇＳ／Ｐｖａｌｕｅａｓｔｈｅｃｒｉｔｅ－ ｒｉａｂｙｓｅｔｔｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＳｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈＳ／Ｐｒａｔｉｏｓｍｏｒｅｔｈａｎｏｒｅｑｕａｌｔｏ０．３７ｗｅｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｏｓｅｌｅｓｓｔｈａｎ０．３２３ａｓｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｔｗａｓｓｕｓｐｉｃｉｏｕｓ．ＴｈｅＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄｗａｓｐｒｏｖｅｄｔｏｈａｖｅｎｏｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔ