基因治疗2医学培训课件.ppt

* * * * * （2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 AV两端各有一个反向重复序列目前作为基因治疗中所用的AV载体通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基因组的E1A-E1B或E3区。 ITR E2 E3 E4 E1 ITR 反向重复序列 包装信号 腺病毒的优点 1.基因导入效率高，对人类安全； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因； 腺病毒载体缺点 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 4.靶向性差（特异性差）。 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。 (1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移示意图 人工脂质体膜具有如下特点： 与体细胞相容，无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03~50 ?m)，包容大小不同的生物活性分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求 缺点：脂质体介导进入靶细胞内，易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。 （2）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中，也可用生理盐水或PBS. 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。 基因直接注射法的优点 1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 （3）受体介导基因转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。 缺点：受体介导的DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。 （4）磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受 体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。 磷酸钙+DNA → 混合微细颗粒 ↓ 沉淀反应20~30min ↓ 细胞在沉淀物中暴露 5~24h 方法简单，但转化效率低。 （5）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲