胎盘球蛋白含量测定.ppt

实验六 胎盘球蛋白含量测定 非蛋白氮 non protein nitrogen (NPN)非蛋白态的含氮化合物（氨基酸、尿素、尿酸、肌酐、胍类、胺类及吲哚 ） 原 理 含氮化合物经H2SO4消化后，化合物中碳氧 化成CO2而除去，氮则全部与H2SO4作用，生成 (NH4)2SO4，加钠氏试剂后，产生黄色化合物， 可作定量测定。 由胎盘球蛋白的总氮量与非蛋白氮（NPN）含 量的差，可算得蛋白质氮量，通过蛋白质含氮量， 可换算蛋白质含量。 样 品 1、胎盘球蛋白稀释液： 1毫升胎盘球蛋白注射液用生理盐水稀释至 200毫升 。 2、非蛋白氮（NPN）滤液制备 钨酸法：取胎盘球蛋白0.1毫升于事先加好3.5 毫升蒸馏水之 加入0.2毫升2/3N H2SO4，0.2毫升 10%钨酸钠，稍加放置，用干滤纸过滤即得。 钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，后者使蛋白质沉淀，过滤可得无蛋白滤液 Na2WO4＋H2SO4 H2WO4＋Na2SO4 操 作 消 化 氮量测定 含氮化合物＋H2SO4 ? (NH4)2SO4 消化的目的：使有机氮（氨基酸上的－NH2)转化为NH4+。 亚硒酸消化液：H2SeO3 和 H2SO4 作用：提高沸点；将有机氮转化为NH4+ 显色剂 钠氏试剂 ：碘化汞、碘化钾 、NaOH 碘化汞＋碘化钾 碘化钾汞复盐 (NH4)2SO4＋2NaOH ? 2NH4OH＋Na2SO4 NH4OH＋2(KI)2HgI2＋3NaOH Hg 4KI＋3NaI＋3 H2O＋O NH2I Hg 碘化双汞铵 黄棕色沉淀 计 算 NPN含量mg%＝ 总N含量mg%＝ 蛋白N%＝总N%－NPN% 蛋白质含量＝蛋白N×6.25 注：蛋白质含量应不低于5% 思考题 实验中使用浓硫酸、钨酸钠、亚硒酸、 酒石酸钾钠的目的分别是什么？ 答 案 浓硫酸：消化蛋白，吸收释放出来的NH3，使之 成为NH4+。 钨酸钠：沉淀蛋白质，除去蛋白氮 亚硒酸：催化剂，加速消化速度。可以用CuSO4 代替。 酒石酸钾钠：络合剂，出去重金属离子对显色的 影响。 * * 氮含量 蛋白质含量 ＝ 16％ 蛋白质含量 ＝ 氮含量 × 6.25 蛋白质主要包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ 氮元素是蛋白质区别于糖和脂的特征性元素 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16% ＝ 总氮含量 － 非蛋白氮含量 （ ） × 蛋白质含量 6.25 胎盘血来源的丙种球蛋白 含蛋白质５％ 2.0 2.0 2.0 2.0 钠氏应用液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 10%酒石酸钾钠（ml） 2.5 2.5 3.5 3.5 蒸馏水 1.0 标准(NH4)2SO4 消化至溶液有黑变澄清 0.1 0.1 亚硒酸消化液（ml） 0.25 胎盘球蛋白稀释液（ml） 1.0 NPN滤液（ml） 空 标准管 NPN管 总氮管 各管混匀后，于460nm处比色 总氮管 NPN管 标准管 空白管 样品稀释液 NPN滤液 标准硫酸氨 蒸馏水 样品OD 标准OD ×0.01×40×100 样品OD 标准OD ×0.01×800×100 *